甘薯膜結合態多酚氧化酶同源建模及分子對接分析

李豐茂，楊 浩，2，傅玉凡，陳曉玲，唐云明

1.西南大學 生命科學學院/重慶市甘薯工程研究中心，重慶 400715；2.重慶市潼南中學校，重慶 潼南 402660；3.中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO，EC 1.10.3.1)是一類由核基因編碼含銅質體能催化酚類物質氧化的金屬酶．最早由Yoshida在研究漆樹液汁凝固現象時發現的一種活性物質，隨后Keilin和Mann 報道了多酚氧化酶的分離純化方法，公布了多酚氧化酶的理化性質及酶學特征[1]，開啟了對多酚氧化酶的系統性研究．國際生物化學和分子生物學聯合命名委員會根據酶的催化特性將PPO 分為兩大類：1) 單酚酶(EC 1.14.18.1)；2) 二酚酶(EC 1.10.3)，包括兒茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)和漆酶(EC 1.10.3.2)[2]．目前在植物體中多酚氧化酶主要以可溶性多酚氧化酶(soluble polyphenol oxidase，sPPO)和膜結合態多酚氧化酶(membrane-bound polyphenol oxidase，mPPO)兩種形式存在，其亞細胞定位在細胞質和葉綠體中[3]．多酚氧化酶參與植物光合作用[4]、逆境脅迫[5]、抗病蟲害[6]、花色形成[7]、生物組織修復[8]，對植物生長發育起到了積極的作用．目前，該酶在茶葉發酵[9]、造紙工業[10]、污水處理[11]等領域得到了廣泛應用．

甘薯(Ipomoeabatatas(L.) Lam)又名紅薯，是我國主要糧食經濟作物之一，產量居全球之首，而西南地區甘薯種植面積居全國第一．據研究報道，甘薯潛在的營養和藥用價值非常高，甘薯富含淀粉[12]、蛋白質、膳食纖維[13]、維生素[14]、酚類[15]、黃酮[16]、胡蘿卜素[17]，具有增強免疫力、抗氧化、抗心血管疾病和抗腫瘤等藥理作用[18-20]；而在工業能源方面，甘薯淀粉作為原料發酵和生產燃料酒精和酒精汽油[21]，以緩解目前的能源危機．近年來，鮮切甘薯因營養豐富、便捷以及高利用率等特點迅速得到廣大消費者的青睞[22]．但是鮮切甘薯在生產過程中容易受到機械力的傷害，多酚氧化酶與酚類化合物原本的細胞區域被破壞，在氧氣作用下甘薯表面生成棕色或黑色聚合物導致甘薯表面出現褐變，褐變不僅會影響甘薯外觀，降低營養價值，還能導致甘薯變質腐爛和浪費，從而制約著甘薯產業的發展．目前有研究顯示PPO是導致果蔬褐變的主要物質[22-23]，而mPPO是甘薯中主要的多酚氧化酶，當甘薯組織受到損傷后，其編碼基因被誘導表達，mPPO活性逐漸增加，加速果蔬褐變腐爛，然而有關mPPO導致褐變的分子機制尚不明確，因此本研究主要利用同源建模和分子對接手段快速得到mPPO三維結構以及與底物結合的潛在位點，為篩選和設計抑制劑以及深入理解褐變機理提供了新的理論基礎．

1 材料與方法

1.1 材 料

生物信息學數據庫，如Uniprot(Universal Protein：https：//www.uniprot.org/)，PDB(Protein Date Bank：https：//www.rcsb.org/)；在線軟件，如SWISS-MODELL，PISPRED，PROCHECK，ERRAT，SYBYL-X 2.0；本課題研究的甘薯膜結合態多酚氧化酶氨基酸序列來自Uniprot數據庫(登錄號：Q9MB14)．

1.2 方 法

1.2.1 同源建模

先從Uniprot數據庫中下載甘薯膜結合態多酚氧化酶氨基酸序列，然后在蛋白質自動同源建模軟件SWISS-MODELL中輸入相應序列構建甘薯mPPO三維結構，通過建模反饋信息，獲得了4個模板和1個目標模型(即mPPO三維結構)，并將mPPO的三維結構保存為PDB格式以用于后續分子對接分析．

1.2.2 模型評估

利用在線蛋白質三維結構評估軟件PROCHECK和ERRAT對所獲得的甘薯mPPO模型進行評估以及對氨基酸殘基(aa)整體性進行分析．

1.2.3 分子對接分析

從TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)數據庫中(https：//tcmspw.com/molecule.php?qn=415)下載底物鄰苯二酚、綠原酸、沒食子酸、焦性沒食子酸、表兒茶素等酚類化合物3D結構，并保存為mol2格式，然后利用分子對接軟件SYBYL-X 2.0以銅質體區域為對接位點，采用半柔性對接方式進行分子對接分析，探究mPPO與酚類化合物的潛在結合位點以及相互作用方式[24]．

2 結果與分析

2.1 模型及其結構分析

同源建模是利用具有同源性的蛋白質三維結構作為模板，對目標蛋白質進行三維結構預測．由于蛋白中的三維結構比蛋白質一級結構更加保守，氨基酸的突變和替換通常發生在蛋白質表面回折區域，蛋白質主鏈結構、疏水核心結構受序列變異影響很小．因此用同源建模預測蛋白質三維結構是比較可靠、快速的方法．任何一對蛋白質，只要序列長度達到一定程度，序列相似性超過30%，則具有相似的三維結構[25]．由于甘薯mPPO研究仍處于轉錄水平，蛋白質結構數據庫中也無相應的結構信息．利用SWISS-MODELL對甘薯mPPO同源建模，一共獲得了4個多酚氧化酶三維結構模板，其在PDB數據庫中的登錄號分別為6ELS(Latent apple tyrosinase)，4Z11(Latent aurone polyphenol oxidase)，6R83(squid hemocyanin)，4D87(Bacillus megaterium tyrosinase)，氨基酸序列相似性分別為54.49%，44.02%，21.23%，23.57%．由于序列相似性越高，獲得的三維結構越可靠，因此選取了序列相似性最高的6ELS作為模板建模(圖1)，使獲得的模型最佳，其甘薯mPPO模型如圖2．

圖1 甘薯mPPO與模板6ELS序列比對

圖2 模板6ELS和甘薯mPPO三維結構

通過甘薯mPPO與模板6ELS序列比對以及利用PISPRED對mPPO二級結構預測發現，mPPO二級結構含有18個α-螺旋、9個β-轉角、18個無規則卷曲(圖3)，其1～50 aa和51～88 aa為2段跨膜信號序列，說明葉綠體內的mPPO會通過轉移肽轉移至細胞質內發揮作用．結合圖2可以看出甘薯mPPO活性區域含有3個CuA和3個CuB，并被His178，His199，His208，His330，His334，His366包圍．Cys99→Cys116，Cys115→Cys179，Cys182→Cys199組成了mPPO鏈間二硫鍵穩定著酶的結構．

圖3 甘薯mPPO二級結構

2.2 模型評估

將SWISS-MODEL建模后序列相似性最高的mPPO模型通過PROHECK和ERRAT進行評估，圖4(a)顯示了mPPO拉式構象圖中有92%殘基位于允許區[A，B，L]，7.2%殘基位于最大允許區域[a，b，l，p]，0.5%殘基位于扭轉角禁止區域[～a，～b，～l，～p]，一般認為允許區域超過90%，模型中蛋白質殘基的二面角都在合理的區間，則符合立體化學能量規則，表明其模型的可靠性較高[26]．圖4(b)，圖4(c)顯示mPPO的 QMEAN為0.67(QMEAN值在 0～1 之間，數值越大，獲得理想模型的可能性越大[27])，且Z值均大于2，反映出模型質量可靠．ERRAT對mPPO整體三維結構進行評估，有95.15%的殘基在95%誤差值以外，綜上所述甘薯mPPO模型合格(圖4d)，可以用于后續分析計算．

圖4 mPPO模型評估

2.3 催化位點分析

分子對接是在分子水平上通過化學計算研究分子的幾何結構、分子間相互作用的方法，其理論基礎來源于E.Fisher 提出的“鎖鑰模型”，該模型描述了酶與底物專一性的結合，但存在一定局限性．Koshland提出了“誘導契合原理”，該理論認為受體和配體在相互結合時會發生結構變化[28]．利用分子模擬軟件SYBYLX-2.0分別將鄰苯二酚、綠原酸、沒食子酸、焦性沒食子酸、表兒茶素與mPPO進行分子對接，在對接過程中蛋白受體和小分子配體的構象是可柔性可變化的，以滿足空間形狀和能量匹配．結果發現在活性位點附近，Gln197，Leu212，Phe204，His365，Phe362，Phe205，Arg209，Thr331以氫鍵的方式與5種酚類化合物結合(表1)，說明這幾個殘基都是潛在結合位點(圖5)．

表1 甘薯mPPO與不同底物結合位點

圖5 甘薯mPPO與酚類化合物分子對接結果

3 討論與結論

蛋白質作為生命活動承擔者，其具有的功能很大程度上與自身的空間結構有關，因此，對蛋白質空間結構的研究有助于了解其工作機理．目前蛋白質數據庫收集的蛋白質結構數量不斷增加，但是蛋白質結構的測定仍然落后于基因測序[29]．X-射線晶體衍射和核磁共振技術是獲取蛋白質結構信息的重要手段，但蛋白質晶體表達、提純與結晶增加了測定的難度．為了加快蛋白質結構測定速度，發展理論蛋白質結構測序方法顯得尤為重要．因此，利用蛋白質相關的數據庫信息進行生物信息學分析不僅可以快速了解、認識目標蛋白質，還可以快速、高效地解析蛋白質的結構和功能，以研究蛋白質與配體的相互作用及其分子機制．

通過分析氨基酸序列發現，mPPO二級結構含有18個α-螺旋、9個β-轉角、18個無規則卷曲，其中1～50 aa，51～88 aa為2段跨膜信號序列，這與茄子(81 aa)，蘋果(89 aa)，土豆(86 aa)，番茄(99 aa)mPPO跨膜轉移肽不同[30]，植物mPPO N-端轉移肽差異可能與不同物種mPPO轉運方式有關．銅質體區域是甘薯mPPO活性部位，受His178，His199，His208，His330，His334，His366包圍，而在單亞基甘薯多酚氧化酶中，只存在單個銅質體，并被His240，His244，His274包圍，葡萄PPO中活性區域受His211，His220，His342，His346，His375包圍[31]，這表明PPO活性區域差異與所編碼的基因以及所在區域的執行功能有關．

分子對接結果顯示，甘薯mPPO中Gln197，Leu212，Phe204，His365，Phe362，Phe205，Arg209，Thr331等殘基與鄰苯二酚、綠原酸、沒食子酸、焦性沒食子酸、表兒茶素相互作用，表明甘薯mPPO不僅催化區域廣，而且催化底物種類多，而甘薯組織受到機械傷害時，能與各種酚類物質反應，驗證了多酚氧化酶是導致果蔬褐變的主要氧化酶．氫鍵驅動mPPO和底物結合，正是由于他們之間的這種分子相互作用，使得甘薯mPPO與底物結合的親和力高，促進了甘薯mPPO催化效率．因此，可以通過結合位點設計抑制劑屏蔽掉相關氨基酸殘基上的官能團，削弱與酶的結合能力，該實驗結果還可以通過基因敲除或者RNA干擾技術培育無褐變甘薯品種，擴大甘薯物種豐富度，降低因褐變造成的經濟損失．

綜上所述，本實驗挖掘甘薯mPPO相關數據掌握了其結構特征以及潛在催化靶點，為進一步揭示甘薯褐變分子機制和篩選高效無毒害抑制劑提供了新的思路．