蘆筍液體發酵靈芝工藝及其對多糖質量濃度的影響

董玉瑋，沙爽，張浩赟，周立輝，陳學紅，曹修春

1.徐州工程學院食品與生物工程學院（徐州 221018）；2.徐州山崎農產品技術研發有限公司（徐州 221700）

蘆筍（學名：Asparagus officinalisL.）為石刁柏的幼苗，為百合科天門冬屬。蘆筍含有豐富的氨基酸、膳食纖維和礦物質元素，皂苷、多糖、黃酮類[1]等活性物質；具有抗癌[2-3]、抗衰老[4]、抗紫外線[5]、預防心腦血管疾病[6]。靈芝為多孔菌科真菌，其有效成分是三萜類、多糖，具有很強的抗氧化性和清除自由基能力[7]，被古今中外醫藥學家視為滋補養生、強身壯體的珍品[8-9]。

蘆筍的市場需求量及交易量逐年增加，高品質蘆筍主要用于出口，而低品質的蘆筍利用率較低，其主要原因是纖維素和木質素在低品質和長期貯藏的蘆筍中含量高，口感差。將這部分蘆筍進一步開發利用將有利于提升其利用價值。靈芝等藥食真菌菌絲體能利用纖維素、木質素為碳源，產生多糖、三萜類等活性物質。因此如果以低品質蘆筍為原料，采用液體深層發酵技術，制備發酵型藥食真菌，將具有生產成本小、產量較大、操作方便快捷、生產效率顯著提高等優勢[10]。相比于傳統的化學試劑，液體發酵更符合綠色環保的理念，在產品質量和操作可控制性方面有明顯優勢[11]。李弈等[12]研究發現，液體發酵生產藥用真菌代用品可有效解決天然藥用真菌資源逐漸枯竭和生態環境保護的難題，是一種天然健康的發酵工藝。

以低品質蘆筍為培養基，液體發酵靈芝，根據多糖質量濃度優化其發酵工藝，并對發酵液中的理化成分進行的測定，為蘆筍、藥食真菌精深加工產業發展提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑和儀器

1.1.1 試驗材料和試劑

靈芝菌種（實驗室保存高活性靈芝菌種）；蘆筍（品質低于出口標準，徐州山崎農產品技術研發有限公司）；乙醇、濃硫酸、苯酚、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等（均為國產分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司）。

1.1.2 試驗儀器和設備

DHP-9032電熱恒溫培養箱（上海一恒儀器有限公司）；HH-2電熱恒溫水浴鍋（邦西儀器科技（上海）有限公司）；XFH-50CA手提式壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新豐醫療器材有限公司）；HYG-II回旋式恒溫調速搖瓶柜（上海欣蕊自動化設備有限公司）；TDL-5A低速大容量離心機（上海圣科儀器設備有限公司）；JA1003N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；1260液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；ICP-MS電感耦合等離子體質譜儀（美國Thermo公司）。

1.2 培養基的配制

1.2.1 PDA培養基

PDA培養基：200 g土豆，洗凈去皮切碎，加1 000 mL水，煮25 min，濾渣取液體，向其中加磷酸二氫鉀3 g，瓊脂粉20 g，葡萄糖20 g，酵母膏3 g，硫酸鎂1.5 g和微量VB1，加熱攪拌，溶解后，加水補充到1 000 mL，裝于三角瓶內，高壓滅菌40 min，取出備用。

1.2.2 液體發酵培養基

蘆筍液體培養基：蘆筍粉碎后，按0.25%～1.25%裝入三角瓶，加入1%酵母膏，2%可溶性淀粉，100 mL水配成液體發酵培養基。高壓滅菌后，取出冷卻至室溫。

1.3 靈芝菌種的活化和培養

將靈芝菌種在無菌操作臺內接入PDA斜面培養基中，于28 ℃培養箱培養5～6 d。挑選長勢好的菌種，接種在液體培養基中，于28 ℃搖床培養6～8 d。

1.4 單因素試驗

以蘆筍添加量、溫度、裝液量3個因素為考察對象，每組試驗重復3次。

1.4.1 蘆筍添加量

分別向三角瓶中加入0.25，0.50，0.75，1.00和1.25 g粉碎后的蘆筍，加入100 mL液體培養基，高壓滅菌后接種，于28 ℃搖床培養5～7 d。

1.4.2 溫度

分別向裝有100 mL液體培養基的三角瓶中加入0.75 g粉碎后的蘆筍，高壓滅菌后接種，分別放入溫度為24，26，28，30和32 ℃的搖床，培養5～7 d。

1.4.3 裝液量

依次向三角瓶中加入0.75 g粉碎后的蘆筍，分別加入60，80，100，120和140 mL的液體培養基，高壓滅菌后接種，于28 ℃搖床培養5～7 d。

1.5 正交試驗設計

選取溫度、蘆筍質量分數、裝液量3個因素，每個因素選取3個水平。試驗因素與水平如表1所示。

表1 試驗的因素與水平

1.6 多糖的提取及測定

1.6.1 粗多糖的提取方法

將培養后的發酵液以4 000 r/min離心10 min，取上清置于50 ℃烘箱中烘至原體積1/5，加入5倍體積95%乙醇，在4 ℃冰箱中過夜醇沉后，以4 000 r/min離心5 min，取沉淀于50 ℃烘箱烘干，得粗多糖。

1.6.2 多糖質量濃度的測定——苯酚硫酸法

將1 g粗多糖加入100 mL蒸餾水充分溶解，取2 mL多糖溶液，加1 mL 6%苯酚、5 mL濃硫酸，混勻，100℃水浴15 min，冷卻至室溫，在490 nm處測定樣品吸光度，對照組為蒸餾水。通過葡萄糖標準曲線計算多糖質量濃度。

1.6.3 粗多糖的純化

Sevag法脫蛋白：將1 g粗多糖加入10 mL純水溶解，加入2.5 mL Sevag試劑（V（氯仿）∶V（正丁醇）=5∶1），將混合溶液裝入分液漏斗中振蕩18～20 min，取上層溶液以4 000 r/min離心15 min，棄下層液體，上清液重復上述操作，至無蛋白質層，合并上清液備用。

取截流相對分子質量6 000～8 000的半透膜袋，沸水水浴5 min，用純水將其沖開，封住一端，將得到的上清液倒入后封住開口的另一端，置于裝有純水的燒杯中，用磁力攪拌器進行透析，每2 h換1次水，2 d后得到樣品烘干即為精制多糖。

1.6.4 葡萄糖標準曲線的制作

取50 mg葡萄糖標準品溶解，制成1 mg/mL葡萄糖標準溶液。取5 mL葡萄糖標準溶液稀釋10倍，取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mL標準液分別裝于試管中，加蒸餾水至2.0 mL，另取一支試管加2 mL蒸餾水，分別加入6%苯酚和5 mL濃硫酸，搖勻靜置5 min后，于100 ℃水浴15 min，冷卻至室溫，在490 nm處測吸光度。標準曲線回歸方程為Y=9.092 9X+0.013 6，R2=0.994 8。

1.7 氨基酸組分檢測

HPLC檢測氨基酸參考鄧代信等[13]的方法。

1.8 高效液相色譜檢測

多糖中加入0.5 mL 2 mol/L三氯乙酸溶液，于120℃ 水解100 min，用氮吹儀吹干，得樣品。

取5 μL單糖標準品加入試管中，加入0.5 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，與上述多糖樣品一同放置在120 ℃水浴下水解100 min，空氣泵吹干。

處理好的單糖樣品加入0.5 mL 0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）試劑，0.5 mL 0.3 mol/L NaOH溶液。充分混勻后，于70 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，加入0.5 mL氯仿和0.5 mL 0.3 mol/L HCl，充分振蕩萃取，以5 000 r/min離心5 min，除去氯仿層后重復2次萃取。用0.22 μm濾膜過濾水層，待測定。

儀器條件：波長245 nm，流動相為0.1 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），進樣量10 μL。

1.9 礦物質元素檢測

Mg、Fe、Se、Ca、Zn等元素質量分數采用電感耦合等離子體-質譜（ICP-MS）法測定[14]。取適量樣品放入聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL硝酸。靜置，反應結束后，蓋蓋密封，放入微波消解儀，溫度冷卻到50 ℃以下，取出消解罐放入通風櫥中，打開消解罐，用超純水潤洗，轉移至50 mL容量瓶中，潤洗3～4次，用超純水稀釋、定容至刻度，待測。空白對照同法處理。ICP-MS儀器參數：射頻功率1 550 W，泵速40 r/min，霧化室溫度2.7 ℃，采樣深度5 mm，冷卻氣流速14 L/min，輔助氣流速0.8 L/min，霧化氣流速1.122 L/min。

1.10 數據分析

采用Origin 9.0軟件處理數據并作圖，所有數據用“平均值±標準差”表示。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 蘆筍質量分數對多糖質量濃度的影響

如圖1所示，蘆筍質量分數0.25%～1.25%時，隨著蘆筍質量分數增加，多糖質量濃度先增加后減少，蘆筍質量分數0.75%時，多糖質量濃度達到最大值2.33 mg/mL。辛燕花等[15]研究何首烏發酵靈芝工藝時也有類似結果，發現何首烏含量0.7%～0.8%時，多糖質量濃度最高。

圖1 蘆筍質量分數對發酵液中多糖質量濃度的影響

2.1.2 裝液量對多糖質量濃度的影響

如圖2所示，錐形瓶裝液量60～100 mL時，多糖質量濃度隨著裝液量增加，先增加后減少，裝液量100 mL時，多糖質量濃度達到最大值2.24 mg/mL。田淑雨等[16]通過單因素試驗研究靈芝多糖提取得率時，發現裝液量90～100 mL時，所獲得的多糖量最高，與試驗結果基本一致。

圖2 裝液量對發酵液中多糖質量濃度的影響

2.1.3 溫度對多糖質量濃度的影響

如圖3所示，溫度范圍24～28 ℃時，隨著溫度增大，多糖質量濃度先增加后減少，溫度28 ℃時，多糖質量濃度達到最大值2.51 mg/mL。馮嫣等[17]研究靈芝孢子粉提取多糖工藝時，發現溫度28 ℃時，所得到的多糖質量濃度為2.6 mg/mL，與試驗結果基本一致。

圖3 溫度對發酵液中多糖質量濃度的影響

2.2 正交試驗

正交試驗設計方案，通過具體試驗得到多糖質量濃度，如表2所示。

表2 設計方案和結果

從表2結果可以看出，極差項R大小為A＞C＞B，即溫度的影響因素最大，其次是裝液量，最后是蘆筍質量分數。綜合3種因素對液體發酵靈芝多糖影響可知，發酵工藝最優組合為A2B2C2，即液體發酵溫度28 ℃、蘆筍質量分數0.75%、裝液量100 mL時所得發酵液中多糖質量濃度最高。以A2B2C2為優化條件設計正交試驗驗證試驗，最終得到多糖質量濃度為2.73 mg/mL。

2.3 多糖中單糖組分檢測

每種單糖標準曲線方程為：葡萄糖y=62.22x+270.7，R2=0.999 09；甘露糖y=82.26x+86.27，R2=0.999 94；阿拉伯糖y=71.82x+277.47，R2=0.999 26；半乳糖y=78.79x+207.08，R2=0.999 71；木糖y=57.01x+302.88，R2=0.998 53；半乳糖醛酸y=87.49x-60.39，R2=0.999 96；葡萄糖醛酸y=86.51x-61.36，R2=0.999 98。蘆筍-靈芝多糖中所含單糖組分色譜圖見圖4，質量分數見圖5。

圖4 多糖中單糖組分的高效液相色譜圖

圖5 多糖中單糖組分質量分數

從檢測結果中可以看出，多糖由甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6種單糖組成，其中葡萄糖質量分數最高，為282 591.33 mg/kg。隋曉辰等[18]通過對深層發酵靈芝胞內多糖結構分析得出，胞內多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖等5種成分組成，其種葡萄糖、半乳糖、甘露糖摩爾比83.75∶4.76∶4.15，其中葡萄糖量最大；黃靜涵等[19]分離純化靈芝多糖，得出靈芝單糖組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木聚糖，物質的量比率為4∶2∶10∶1，葡萄糖物質的量最高，均與試驗結果基本一致。

蘆筍-靈芝發酵液經高效液相色譜測定含有多種氨基酸，見圖6。

圖6 氨基酸組分的高效液相色譜圖

氨基酸與礦物質元素質量分數見圖7。從圖7可以看出，發酵液中含有賴氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等多種氨基酸，其中脯氨酸質量分數最高，為3.9 g/kg。鐵、鋅、鎂、硒、鈣等礦物質元素中鈣質量分數最高，達68.6 g/kg，硒為0.03 mg/kg。隋月紅等[20]研究發現，嫁接紅棗中鈣質量分數最高達0.76 g/kg，硒為0.005 9 mg/kg，均低于發酵液中鈣和硒質量分數。

圖7 蘆筍-靈芝液體發酵液中理化指標測定結果

發酵液還中含有7種人類必需的氨基酸，營養價值較高。脯氨酸質量分數最高，能夠幫助分解蛋白質，是理想的滲透調節物質。亮氨酸、異亮氨酸等部分苦味氨基酸，有利于蛋白質向氨基酸轉化、形成和積累。呈鮮味氨基酸天冬氨酸、谷氨酸占比19%，9種藥效氨基酸占比52%，必需氨基酸與氨基酸總量比值29%，必需氨基酸與非必需氨基酸比值40%。說明制備的蘆筍-靈芝口感鮮美，營養物質豐富，具有很高的藥效價值。黃清鏵等[21]研究發現，靈芝發酵甘蔗汁中呈鮮味氨基酸占比32%，必需氨基酸與氨基酸總量比值34%，必需氨基酸與非必需氨基酸比值51%，與發酵液研究結果相似。

3 結論

1) 單因素試驗表明，培養基中蘆筍質量分數0.50%～1.00%、裝液量80～120 mL、培養溫度26～30 ℃時，能獲得較高多糖質量濃度。

2) 正交試驗優化得出最佳方案：蘆筍質量分數占總裝液量的0.75%，裝液量100 mL，溫度28 ℃，此時得到的多糖質量濃度最高，為2.64 mg/mL。

3) 發酵液多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖等單糖組成，其中葡萄糖質量分數最高，為282.59 g/kg；氨基酸中脯氨酸質量分數最高，達3.9 g/kg，礦物質元素鈣、硒質量分數分別達68.6 g/kg和0.005 9 mg/kg。