花椒葉揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性

羅愛國(guó)，楊奇秦，李智博，楊艷君，胡變芳

晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系（晉中 030619）

花椒（ZanthoxylumL.）又名大椒，為蕓香科、花椒屬落葉灌木，是一種傳統(tǒng)的藥食兩用食物[1-2]，也是中國(guó)傳統(tǒng)調(diào)味品[3]。據(jù)中國(guó)林業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2018年中國(guó)花椒產(chǎn)量約45.85萬 t。花椒葉作為花椒種植采收產(chǎn)業(yè)的最大副產(chǎn)物，資源豐富，但是沒有被充分綜合利用，大量花椒葉被丟棄或焚燒[4]。研究表明，花椒含有多種對(duì)人體有益的活性物質(zhì)，揮發(fā)油是其主要活性成分之一[5]，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤和抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種功效[5-8]，此外還可緩解疼痛、活血化瘀[5,9]，因此揮發(fā)油在食品加工和醫(yī)藥行業(yè)具有較好的應(yīng)用前景。

花椒葉揮發(fā)油成分復(fù)雜，樊經(jīng)建[10]用水蒸氣蒸餾方法制備花椒葉揮發(fā)油并以氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)其進(jìn)行成分分析，鑒定出化合物15種，定量9種。李焱等[11]研究得出微波輔助萃取法提取花椒葉揮發(fā)油的最佳工藝條件為液料比5∶1、提取功率464 W。周江菊等[12]對(duì)樗葉花椒葉精油成分及抗氧化活性進(jìn)行化學(xué)分析，得出該種花椒葉是一種天然的抗氧化劑和清除亞硝酸根離子的活性物質(zhì)。不同產(chǎn)地的花椒葉揮發(fā)油的含量及抗氧化活性差別較大[13]。試驗(yàn)以芮城產(chǎn)花椒葉為材料，結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對(duì)花椒葉揮發(fā)油的抗氧化活性進(jìn)行初步探究，以期為芮城花椒葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒葉（產(chǎn)自山西省運(yùn)城市芮城，干燥后粉碎，過0.425 mm篩）。

石油醚（沸程60～90 ℃，分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；正己烷（分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；鄰苯三酚（分析純，北京索萊寶科技有限公司）；抗壞血酸（分析純，北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平（FR1004，常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（DZKW-D-2，天津天泰儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52系列，上海亞榮生化儀器廠）；電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)（BGZ-70，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；紫外可見分光光度計(jì)（EV-2000，上海昂拉儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花椒葉揮發(fā)油的提取

參照文獻(xiàn)[14]的方法略作修改。精確稱取5 g花椒葉粉末，裝入濾紙包，用細(xì)繩綁好濾紙包，將濾紙包精密稱質(zhì)量后置于250 mL燒杯中，加入提取劑，在設(shè)定好的溫度下進(jìn)行提取，提取時(shí)用封口膜密閉燒杯。提取完成后取出濾紙包于40 ℃干燥3 h，精密稱質(zhì)量。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮提取液，后將花椒葉揮發(fā)油低溫保存在密閉棕色瓶中。試驗(yàn)完成后根據(jù)式（1）計(jì)算花椒葉揮發(fā)油提取率。

式中：M1為未經(jīng)提取的花椒葉濾紙包質(zhì)量，g；M2為經(jīng)過提取并且充分干燥后花椒葉濾紙包質(zhì)量，g；M為濾紙包內(nèi)花椒葉粉末質(zhì)量，g。

1.3.2 椒葉揮發(fā)油提取工藝的優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1.1 提取劑對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響

按照1.3.1揮發(fā)油提取方法，在提取溫度60 ℃、料液比1∶15（g/mL）、提取時(shí)間2 h條件下，考察不同提取劑（乙酸乙酯、乙醚、石油醚、正己烷）對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響。

1.3.2.1.2 提取溫度對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響

按照1.3.1揮發(fā)油提取方法，提取劑采用石油醚，在料液比1∶15（g/mL）、提取時(shí)間2 h條件下，考察不同提取溫度（35，45，55，65和75 ℃）對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響。

1.3.2.1.3 提取時(shí)間對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響

按照1.3.1揮發(fā)油提取方法，提取劑采用石油醚，在料液比1∶15（g/mL）、提取溫度60 ℃條件下，考察不同提取時(shí)間（1，2，3，4和5 h）對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響。

1.3.2.1.4 料液比對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響

按照1.3.1揮發(fā)油提取方法，提取劑采用石油醚，在提取溫度60 ℃、提取時(shí)間2 h條件下，考察料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30 g/mL）對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在確定提取劑的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）3個(gè)因素為影響花椒葉揮發(fā)油提取率的主要因素，結(jié)合正交設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用L9(33)進(jìn)行因素水平安排和試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.3.3 花椒葉揮發(fā)油抗氧化活性的測(cè)定

1.3.3.1 揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

依據(jù)文獻(xiàn)[12]方法，稍加改動(dòng)。取2.0 mL花椒葉揮發(fā)油提取液，加入2.0 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液，混勻后室溫避光反應(yīng)25 min，以無水乙醇為空白對(duì)照，在517 nm處測(cè)得的吸光度為As；測(cè)得2.0 mL蒸餾水+2.0 mL DPPH溶液的吸光度為A0；2.0 mL樣品溶液+2.0 mL無水乙醇的吸光度為Ac。用VC作對(duì)照[12,15]，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基清除率按式（2）計(jì)算。

1.3.3.2 揮發(fā)油對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定

向試管中加入0.5 mL 10 mmol/L的水楊酸、1 mL花椒葉揮發(fā)油提取液、0.5 mL 10 mmol/L的FeSO4溶液和0.5 mL 30%的H2O2溶液，混勻后在37 ℃下恒溫反應(yīng)10 min，在510 nm處測(cè)定吸光度A1；按照上述條件不變，用蒸餾水替換H2O2溶液，記錄其吸光度A2；不加樣品測(cè)定的吸光度為A0。以VC做對(duì)照試驗(yàn)，每組3次重復(fù)，取平均值。羥自由基清除率按式（3）計(jì)算。

1.3.3.3 揮發(fā)油清除超氧陰離子能力的測(cè)定

吸取3 mL濃度50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2），置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min后加入0.5 mL花椒葉揮發(fā)油提取液和0.6 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴保溫5 min，取出后加入0.5 mL 8 mmol/L的HCl，在299 nm下測(cè)定吸光度，記為A1；以蒸餾水代替花椒葉揮發(fā)油提取液，測(cè)定的吸光度記為A0。以VC做對(duì)照試驗(yàn)。按式（4）計(jì)算超氧陰離子（O2-）清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取劑對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響

提取劑對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，4種溶劑對(duì)花椒葉揮發(fā)油的提取率分別為4.01%，3.44%，4.65%和3.75%，因此，選用脂溶性較強(qiáng)的石油醚作為提取劑，花椒葉揮發(fā)油提取率較高。

圖1 提取劑對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響

提取溫度對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，花椒葉揮發(fā)油的提取率隨著溫度的升高而升高，提取溫度達(dá)到65 ℃時(shí)，花椒葉揮發(fā)油提取率達(dá)到最高，而隨著溫度繼續(xù)升高，花椒葉揮發(fā)油提取率呈下降趨勢(shì)，這可能是由于一方面，花椒葉揮發(fā)油不穩(wěn)定，溫度過高會(huì)使其揮發(fā)，使得率降低；另一方面，溫度過高使得石油醚揮發(fā)速度過快而無法繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。因此，選擇花椒葉揮發(fā)油的提取溫度55，65和75 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 提取溫度對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，花椒葉揮發(fā)油提取率逐漸升高，且在3 h時(shí)達(dá)到最高，之后稍有下降，并逐漸趨于平穩(wěn)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的提取，揮發(fā)油部分成分不穩(wěn)定而分解。因此，選擇花椒葉揮發(fā)油提取時(shí)間2，3和4 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 提取時(shí)間對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響

2.1.4 料液比對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響

料液比對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響見圖4。由圖4可知，料液比1∶20（g/mL）時(shí)，花椒葉揮發(fā)油提取率最高，為4.79%，超過20倍量時(shí)，逐漸趨于穩(wěn)定。總體而言，花椒葉揮發(fā)油提取率在設(shè)定的料液比梯度范圍內(nèi)波動(dòng)不大，受料液比的影響程度較小。因此，選擇花椒葉揮發(fā)油提取料液比1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 料液比對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由正交試驗(yàn)結(jié)果（表2）可知，影響花椒葉揮發(fā)油提取率的3個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響順序?yàn)锽＞A＞C，即提取時(shí)間是對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取影響最大的因素，提取溫度次之，料液比的影響最小。方差分析結(jié)果（表3）表明，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)花椒葉揮發(fā)提取率的影響顯著（0.01＜p＜0.05），料液比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著。結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析結(jié)果，提取花椒葉揮發(fā)油的最佳工藝水平為A2B2C3，即提取溫度65 ℃、提取時(shí)間3 h、料液比1∶25（g/mL）。

表2 L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 方差分析

2.3 抗氧化活性分析

VC和花椒葉揮發(fā)油抗氧化活性比較見圖5。花椒葉揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧自由基具有較好的清除作用，清除率分別為91.67%，71.30%和64.25%。與VC相比，花椒葉揮發(fā)油清除DPPH自由基和超氧自由基的能力優(yōu)于VC，而對(duì)羥自由基的清除能力低于VC。

圖5 VC和花椒葉揮發(fā)油抗氧化活性比較

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用有機(jī)試劑熱浸法提取花椒葉揮發(fā)油，以揮發(fā)油提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合單因素和正交設(shè)計(jì)，研究提取劑、提取溫度、提取時(shí)間、料液比對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取的影響，得出花椒葉揮發(fā)油的最佳提取工藝：提取劑采用石油醚，提取溫度65 ℃，提取時(shí)間3 h，料液比1∶25（g/mL）。在此條件下花椒葉揮發(fā)油的提取率最高，為5.97%，且各因素對(duì)花椒葉揮發(fā)油提取影響程度由強(qiáng)到弱依次為提取時(shí)間＞提取溫度＞料液比。此外，以VC為對(duì)照，評(píng)價(jià)花椒葉揮發(fā)油的抗氧化能力，結(jié)果表明花椒葉揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基和超氧自由基的清除率大于VC，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，說明花椒葉揮發(fā)油具有開發(fā)成為功效較好的天然抗氧化物質(zhì)的潛能。后續(xù)可對(duì)花椒的不同提取物的抗氧化性能深入研究，有望在食品加工和醫(yī)藥等方面發(fā)揮更大價(jià)值。