甘薯多酚氧化酶酶學性質及電解水對其酶活力抑制效果

于章龍，劉瑞，孫元琳，周素梅，符喜春

1.山西農業大學棉花研究所（運城 044000）；2.運城學院生命科學系（運城 044000）；3.中國農業科學院農產品加工研究所（北京 100193）

甘薯（Ipomoea batatasL.）是我國四大經濟作物之一，產量居世界之首；在我國主要的糧食作物中，僅次于水稻、小麥和玉米，居第四位[1]。其味道甜美、營養價值高，含有豐富的淀粉、膳食纖維、維生素、礦物質元素等，還富含類黃酮、酚酸等天然抗氧化成分，是天然的“生理堿性”食物，具有調節體內酸堿平衡、提高免疫力、促進消化和防癌等作用[2-4]。近年來，國內對甘薯進行了大量的深加工研究，開發出了紅薯干、紅薯蛋白質、紅薯膳食纖維、紅薯飲料、紅薯變性淀粉等產品，并在甘薯化學物質提取、分離純化和生物活性方面進行了深入研究[5-8]。但由于甘薯組織特別是皮層中含有多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO），在甘薯加工過程中PPO與多酚類物質接觸，催化多酚類物質氧化成鄰醌，再進一步氧化聚合成黑色素[9]，使甘薯加工品品質下降，從而制約了甘薯深加工產業開發。因此，深入研究甘薯褐變機理、控制甘薯在加工過程中的褐變，對提高甘薯產業應用價值、充分利用我國豐富的甘薯資源具有重要意義。

目前，抑制酶促褐變的方法有多種。其中常用的抑制劑有亞硫酸鹽、抗壞血酸、檸檬酸、金屬離子、電解水等，但經亞硫酸鹽處理的食品有化學殘留，對身體會造成一定的傷害[10]。電解水是經直流電電解稀鹽溶液所獲得的酸性電解水和堿性電解水的總稱。前人研究表明電解水可有效控制蝦、山藥、蓮藕、蘑菇、馬鈴薯酶促褐變[11-15]。此次研究以晉甘9號為試驗材料，通過研究其PPO的酶學性質，從而確定PPO酶促反應產物的最大吸收波長、PPO的最適作用pH和最適作用溫度，研究常見抑制劑和電解水對PPO活力的影響，創新抑制方式，為有效控制甘薯加工過程中的酶促褐變提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

晉甘9號甘薯，山西省農業科學院棉花研究所提供。所用試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器與設備

UV-9000S型雙光束紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；XY-L-150電生功能滅菌水生成器，寶雞新宇光機電有限責任公司；PH-550 pH計，陸恒生物股份有限公司；萬分之一精密電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；TG16G臺式離心機，天津廣豐科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 甘薯 PPO粗酶液的制備[17]

將洗凈瀝干后的甘薯刮去外層表皮，取甘薯外圍1 cm寬的部分備用[16]。稱取30 g上述樣品，加入40 mL預冷至-18 ℃的丙酮并勻漿，抽濾得濾餅。用冷風將濾餅吹至無丙酮味，即得甘薯丙酮粉。稱取1 g丙酮粉，加入19 mL預冷至4 ℃的pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，振蕩充分混合，然后于11 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液，于4 ℃冷藏備用。

1.3.2 PPO 酶促反應產物最大吸收波長的測定

準確量取1.2 mL甘薯PPO粗酶液、0.8 mL pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液，混合搖勻，反應12 min后在300～600 nm范圍內進行光譜掃描。掃描時間為300 s，每隔5 s記錄吸光度變化，從而確定PPO酶促反應產物的最大吸收波長。

1.3.3 PPO酶活力的測定

在比色皿中加入1.2 mL PPO粗酶液、0.8 mL pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚溶液，在410 nm波長處每隔5 s記錄吸光度的變化，記錄時間為2 min。以每分鐘使吸光度增加0.01所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.4 PPO最適pH的測定

配制pH分別為3.8，4.8，5.8，6.8，7.8和8.8的磷酸氫二納-檸檬酸緩沖液。取1.2 mL PPO粗酶液，分別與0.8 mL上述不同pH的緩沖液混合搖勻，2 min后分別加入1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚，搖勻后迅速在410 nm測吸光度變化，并計算PPO酶活力。

1.3.5 PPO最適溫度的測定

取1.2 mL PPO粗酶液和0.8 mL pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，混合搖勻，分別放入20，30，40，50和60 ℃恒溫水浴鍋中保溫8 min，然后分別加入1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚，搖勻后迅速在410 nm測吸光度變化，并計算PPO酶活力。

1.3.6 PPO酶促動力學參數的測定

取1.2 mL PPO粗酶液，與0.8 mL pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液混合均勻，3 min后分別加入1 mL 0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mol/L鄰苯二酚溶液，搖勻后迅速在410 nm處測吸光度變化，測定不同濃度底物下PPO的活力，作雙倒數曲線，求得PPO酶促動力學參數Km和Vmax。

1.3.7 不同金屬離子對PPO活力的影響

配制0.01，0.015，0.02，0.025和0.03 mol/L的氯化鈉溶液。取1.2 mL PPO粗酶液和0.8 mL上述不同濃度的氯化鈉溶液（對照為等量的pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液），混合搖勻，反應3 min，然后分別加入1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚，搖勻后迅速在410 nm處測吸光度變化，計算酶活力。

0.01 ，0.015，0.02，0.025和0.03 mol/L的氯化鎂、氯化鉀溶液對甘薯PPO酶活力的影響按上述方法測定。

1.3.8 檸檬酸、抗環血酸對PPO活力的影響

配制0.02，0.05，0.1，0.2和0.3 mol/L的檸檬酸溶液。取1.2 mL PPO粗酶液和0.8 mL上述不同濃度的檸檬酸溶液（對照為等量的pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液），混合搖勻，反應3 min，然后分別加入1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚，搖勻后迅速在410 nm處測吸光度變化，計算酶活力。

0.05 ，0.1，0.11，0.13和0.15 mol/L的抗環血酸對PPO活力的影響測定方法同上。

1.3.9 電解水的制備和理化指標的測定

以氯化鈉溶液為電解質，通過調整電解水發生裝置的電流及電解時間制取不同理化指標的電解水。電解水的pH用pH計測定，有效氯濃度（ACC）用碘量法測定。此次使用的電解水理化指標如表1所示。

表1 電解水理化指標

1.3.10 不同有效氯濃度電解水對甘薯PPO活性的影響

不同有效氯濃度電解水理化指標見表1，包括AEW 1（pH 3.35，ACC 20.39 mg/L），AEW 2（pH 3.33，ACC 31.58 mg/L）和AEW 3（pH 3.33，ACC 42.31 mg/L）。取1.2 mL PPO粗酶液，分別與0.8 mL不同有效氯濃度的電解水（對照為等量的pH 4.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液）混合搖勻，反應3 min，然后分別加入1 mL 0.05 mol/L的鄰苯二酚，搖勻后迅速在410 nm處測吸光度變化，計算酶活力。

1.3.11 不同pH電解水對甘薯PPO活性的影響

不同pH電解水理化指標見表1，包括AEW 4（pH 3.50，ACC 32.26 mg/L），AEW 5（pH 4.50，ACC 32.26 mg/L）和AEW 6（pH 5.50，ACC 34.55 mg/L）。不同pH電解水對甘薯PPO活性影響的測定參照1.3.10。

1.4 數據分析

每組數據至少進行3次平行試驗，將數據匯總后取平均值，用SPSS 22.0中的Duncan方差分析比較處理組間的差異顯著性，顯著性水平為p＜0.05。

2 結果與分析

2.1 PPO酶促反應產物最大吸收波長

甘薯PPO酶促反應產物在300～600 nm范圍內的吸光度曲線如圖1所示。在373～410 nm范圍內，隨著波長的增加，吸光度逐漸增大；在410～600 nm范圍內，隨著波長的增加，吸光度逐漸降低。所以甘薯PPO酶促反應產物在410 nm處有最大吸收峰。此結果與田玉庭[18]研究的青蘋果多酚氧化酶的最適波長410 nm結論一致。

圖1 甘薯PPO酶促反應產物全波長掃描圖

2.2 PPO的酶學性質

2.2.1 PPO最適pH

由圖2可知，甘薯PPO活力在pH 4.8時達到極大值，這與李利華[19]研究的萵筍多酚氧化酶的最適作用pH 5.0相近。當pH小于4.8或者大于4.8時，酶活性下降，說明甘薯PPO的活性在偏酸和偏堿的條件下都非常敏感。其原因是PPO為堿性蛋白質，在較強的酸性條件下，輔基銅將以銅離子的形式解離出來，從而使酶失活，而在堿性條件下，輔基銅會解離成Cu(OH)2，使酶活力顯著減低[20]。

圖2 pH對甘薯PPO活力的影響

2.2.2 PPO最適溫度

由圖3可知，當溫度為30 ℃時，甘薯PPO活性達到極大值，此結果與韓秋敏等[21]研究的紫薯多酚氧化酶的最適作用溫度30 ℃的結論一致。

圖3 不同溫度對甘薯PPO活性影響

2.2.3 PPO酶促動力學研究

依據Line weaver-Burk作圖，見圖4。線性回歸方程為y=0.000 6x+0.013 8（R2=0.993 2）。最大反應速率Vmax=72.46 U，米氏常數Km=0.044 mol/L。Km是酶的特征物理常數之一，底物與酶的親和力由Km大小體現。1/Km越大，表明酶對底物的親和力越大，反之則越弱。

圖4 甘薯PPO的Line weaver-Burk圖

2.3 金屬離子對甘薯PPO活力的影響

由圖5可以看出，鎂、鈉、鉀離子對PPO均有一定抑制效果，其中0.03 mol/L NaCl、0.015 mol/L MgCl2和0.01 mol/L KCl對PPO酶活力抑制率較大，分別為23.19%，28.35%和29.77%。

圖5 金屬離子對甘薯PPO酶活力的影響

2.4 檸檬酸、抗壞血酸對甘薯PPO活力的影響

由圖6可看出，當檸檬酸濃度為0.30 mol/L時抑制效果最好，抑制率為23.89%。這可能與加入檸檬酸后改變了反應體系pH以及檸檬酸本身作為螯合劑與PPO中的銅離子結合共同作用降低了PPO活性有關。由圖6可知，隨著抗壞血酸濃度的增加，其對甘薯PPO的抑制作用隨之增強。當抗壞血酸的濃度為0.15 mol/L時抑制效果最佳，抑制率可達74.15%。相比檸檬酸的抑制效果而言，抗壞血酸對PPO抑制效果更好。

圖6 檸檬酸、抗壞血酸對甘薯PPO活性的影響

2.5 電解水對甘薯PPO活性的影響

由圖7可知，隨著強酸性電解水有效氯濃度的逐漸增加，其對PPO活性的抑制作用逐漸增強，pH 3.33、有效氯濃度42.31 mg/L的強酸性電解水對甘薯PPO抑制率可達65.30%。隨著電解水pH的增加，其對甘薯PPO活力的抑制作用略有下降，即強酸性電解水對甘薯PPO活力的抑制效果要好于微酸性電解水。

圖7 電解水對甘薯PPO活性的影響

3 結論

試驗以鄰苯二酚為底物，磷酸氫二鈉-檸檬酸為緩沖液，利用分光光度法對晉甘9號甘薯多酚氧化酶酶學性質、酶促動力學參數以及部分金屬離子、檸檬酸、抗壞血酸和電解水對其酶活力抑制效果進行了研究。結果表明，甘薯PPO酶促反應產物最大吸收波長為410 nm，PPO最適作用pH為4.8，最適作用溫度為30℃，PPO最大反應速率Vmax為72.46 U，米氏常數Km為0.044 mol/L。氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂對甘薯PPO均具有一定的抑制作用，其中0.01 mol/L KCl對PPO酶活力抑制率可達29.77%。抗壞血酸對甘薯PPO的抑制效果優于檸檬酸。其中0.15 mol/L的抗壞血酸對PPO的抑制率可達74.15%。強酸性電解水可有效抑制甘薯PPO活力，其中pH 3.33、有效氯質量濃度42.31 mg/L的強酸性電解水對甘薯PPO抑制率可達65.30%。此研究為有效抑制甘薯PPO活力提供了新方法。