雙酵母混合液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)楊梅果酒

李曉娟

株洲千金藥業(yè)股份有限公司（株洲 412000）

楊梅（Myrica rubra（Lour.）Sieb.et Zucc.）是我國(guó)傳統(tǒng)特色水果，野生楊梅已有7 000年的歷史，種植也有2 000年的歷史[1]。中醫(yī)認(rèn)為，楊梅味甘酸，具有生津止渴和健胃消食等功效[2]，是釀造果酒的優(yōu)良原料。周艷華等[3]采用楊梅和火龍果皮釀造高花色苷的保健楊梅果酒；Chang等[4]采用糯米水解糖液和紅曲等固態(tài)發(fā)酵釀制富含氨基酸、礦質(zhì)元素和香氣的楊梅果酒。酯影響果酒品質(zhì)，釀造時(shí)不僅要保證酒精度而且要提高酯的生成，助于酒香[4-5]，而發(fā)酵溫度和酒精度影響酯生成[6]。雜醇油是酒精發(fā)酵過(guò)程中的副產(chǎn)物，不利果酒質(zhì)量[7-8]。郝瑞穎等[9]研究了葡萄酒釀制的香氣，其雜醇油高于300 mg/L降低葡萄酒質(zhì)量。酵母菌包括釀酒和非釀酒酵母[10]，釀酒酵母活性高，生成酒體中的酒精度[11]，非釀酒酵母促進(jìn)酒體的風(fēng)味物質(zhì)形成[12]，包括畢赤酵母[13]、假絲酵母[14]和梅奇酵母[15]等。兩種酵母混釀可提升果酒品質(zhì)和豐富風(fēng)味口感[16]。安琪干酵母在較低營(yíng)養(yǎng)能發(fā)酵，耐受性強(qiáng)、酒香豐富。產(chǎn)朊假絲酵母被美國(guó)食品藥品監(jiān)督局認(rèn)定為一種安全和可作為食品添加劑[17]，我國(guó)原衛(wèi)生部也將其允許用于保健食品。Chavan等[18]研究天然酵母和非釀酒酵母菌群在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中的影響，以便提高葡萄酒質(zhì)量。

液態(tài)發(fā)酵法釀造果酒發(fā)酵速度快、易于控制[19]。因此，此次試驗(yàn)研究雙酵母混合液態(tài)釀造楊梅果酒綜合技術(shù)，在實(shí)現(xiàn)快速發(fā)酵，滿(mǎn)足酒精度和酯香好的雙重目標(biāo)，并使雜醇油得到合理控制，為快速生產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)良的楊梅果酒提供理論和方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

東槐楊梅，產(chǎn)于福建省長(zhǎng)汀縣；安琪葡萄酒干酵母 BV818、RV171，Angel酵母股份有限公司；產(chǎn)朊假絲酵母CU-6，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC）；大豆多肽，菏澤中食肽好生物制品廠(chǎng)；酵母提取粉（BR），廣東凱微生物科技有限公司；胰蛋白胨（BR）、瓊脂粉（BR）、偏重亞硫酸鉀（AR）、碳酸氫鈉（AR），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖（AR），上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

LZ-0.5型小型螺旋榨汁機(jī)，江蘇科威機(jī)械有限公司；TDL-5-A型低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；DHG-9000型恒溫干燥箱，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-1100型分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；TC8400001型自動(dòng)測(cè)氮儀，F(xiàn)OSS；RE-2200A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；Sartorius普及型pH計(jì)，合肥橋斯儀器設(shè)備有限公司；YXQ-LS-18SII型全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；NSKY-200B型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；YXQ-LS-18SII型全自動(dòng)立式電熱蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Blue Pard型隔水式培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-18SII型全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；A199型GC，Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)及分析方法

還原糖：直接滴定法，按GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測(cè)定》執(zhí)行；總糖：直接滴定法[20]；總氮：凱氏定氮法[21]；氨基酸態(tài)氮：雙指示劑甲醛滴定法；pH：pH計(jì)法[22]；可滴定酸：電位滴定法[23]；可溶性固形物：折光儀法；總果膠：重量法[24]；酵母數(shù)：按GB/T 4789.15—2010《食品微生物檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》執(zhí)行；酒精度：按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》酒精計(jì)法執(zhí)行；甲醇和雜醇油：氣相色譜法，按GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》執(zhí)行。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析方法

應(yīng)用Design Expert（Version 8.0.6）軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊梅果汁的理化指標(biāo)

從表1可看出，楊梅汁的含糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)適中，酸度較高，總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，需適度降酸、提高糖度和添加氮源以滿(mǎn)足酵母生長(zhǎng)和風(fēng)味成分。

表1 楊梅果汁的理化指標(biāo)

2.2 酵母的選擇

2.2.1 酵母菌種的確定

接種量為0.4%，初始還原糖為24 g/100 g，發(fā)酵溫度為24 ℃。由圖1、圖2和表2可知，安琪酵母發(fā)酵時(shí)還原糖2 d內(nèi)快速下降；CU-6發(fā)酵4 d內(nèi)還原糖緩慢降低，發(fā)酵周期較長(zhǎng)。兩種安琪發(fā)酵前期酵母數(shù)增長(zhǎng)快而CU-6較慢，到第3天后生長(zhǎng)明顯加快，安琪BV818、RV171發(fā)酵時(shí)酒體酒精度相對(duì)比較高、殘?zhí)橇枯^低，BV818發(fā)酵的酒精度達(dá)12.6%vol，總酯為1.47 mg/L。CU-6發(fā)酵時(shí)總酯最高，達(dá)到1.76 mg/L，口感較協(xié)調(diào)，因產(chǎn)朊假絲酵母能改善果酒風(fēng)味，使果香濃郁[27-28]，所以選擇發(fā)酵速率最快的BV818和產(chǎn)酯能力最強(qiáng)的CU-6混合發(fā)酵，以達(dá)到產(chǎn)酒和產(chǎn)酯能力好的雙目標(biāo)。

表2 三種酵母的酒精發(fā)酵效果對(duì)比

圖1 不同酵母對(duì)楊梅果酒還原糖的影響

圖2 不同酵母對(duì)楊梅果酒酵母數(shù)的變化

2.2.2 酵母比例的確定

初始還原糖為24 g/100 g，發(fā)酵溫度為24 ℃，接種量為0.4%。由圖3和圖4可看出，采用BV818和CU-6體積比1∶1，1∶1.5和1∶2發(fā)酵時(shí)還原糖下降相對(duì)緩慢，酵母生長(zhǎng)較慢；1.5∶1和2∶1時(shí)，還原糖下降較快，酵母生長(zhǎng)也較好。體積比為1∶1發(fā)酵時(shí)速度慢。經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵至7 d時(shí)，殘?zhí)橇繛?.54 g/100 g，總酯質(zhì)量濃度為2.81 mg/L，經(jīng)品嘗酒質(zhì)柔爽，果香、酒香濃郁。因此，BV818和CU-6的體積比以1∶1為宜。

圖3 酵母體積比對(duì)楊梅果酒還原糖的影響

圖4 酵母體積比對(duì)楊梅果酒酵母數(shù)的影響

2.2.3 多肽添加量的確定

混合酵母接種量為0.4%，初始還原糖為24 g/100 g，于24 ℃進(jìn)行發(fā)酵。從圖5和圖6可看出，多肽0～2 g/L時(shí)，還原糖下降和酵母數(shù)增加緩慢，說(shuō)明氮源不足以維持酵母生長(zhǎng)，酒質(zhì)混濁。多肽4～6 g/L時(shí)，還原糖下降和酵母數(shù)增加相對(duì)較快，酒質(zhì)較柔爽，說(shuō)明多肽能滿(mǎn)足發(fā)酵過(guò)程中所需氮源；多肽4 g/L，發(fā)酵至7 d時(shí)酒精度為8.9%vol，總酯質(zhì)量濃度為2.68 mg/L，發(fā)酵情況最好，酒香、果香濃郁；高于8 g/L時(shí)，還原糖下降較快，酵母生長(zhǎng)過(guò)剩，酵母衰老。因此，多肽選擇4 g/L左右為宜。

圖5 多肽添加量對(duì)楊梅果酒還原糖的影響

圖6 多肽添加量對(duì)楊梅果酒酵母數(shù)的影響

2.3 酒精發(fā)酵的單因素試驗(yàn)與分析

調(diào)整楊梅汁初始還原糖24 g/100 g、多肽4 g/L、雙酵母體積比1∶1，從圖7可看出，酵母0.4%發(fā)酵至第7天時(shí)，酒精度為13.1%vol，總酯為2.68 mg/L，均最高，酒質(zhì)柔爽；酵母過(guò)高酒精度反而降低，使楊梅果酒酒香不足，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)于旺盛。18～22 ℃時(shí)，發(fā)酵緩慢，酒精度不高；24 ℃時(shí)，酒精度增長(zhǎng)最快；28 ℃第3天后，酒精度隨之降低，因溫度過(guò)高，酵母衰老快。pH 3.8發(fā)酵速度較快，至第7天時(shí)酒精度為12.9%vol，之后發(fā)酵速度稍下降。當(dāng)SO2低于20 mg/L時(shí)，隨SO2的增加，發(fā)酵速度加快，酒精度增加；SO2為40 mg/L時(shí)發(fā)酵狀況最好，SO2再增加反而酒精度降低。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，楊梅果酒酒精發(fā)酵以酵母接種量0.4%，溫度24 ℃，SO240 mg/L，pH 3.8為宜。

圖7 單因素對(duì)楊梅果酒酒精度的影響

2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化酒精發(fā)酵工藝條件

在酒精發(fā)酵的單因素試驗(yàn)與分析的基礎(chǔ)上，選取對(duì)酒精發(fā)酵過(guò)程影響較大的接種量（X1，BV818和產(chǎn)朊CU-6的體積比為1∶1）、溫度（X2）、SO2添加量（X3）三個(gè)因子作為考察因素，選擇酒精度和總酯含量作為響應(yīng)值，優(yōu)化酒精發(fā)酵工藝。試驗(yàn)條件為初始還原糖24 g/100 g、多肽添加量4 g/L、初始pH 3.8，發(fā)酵時(shí)間7 d。因素水平見(jiàn)表3，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 楊梅果酒因素水平表

表4 楊梅果酒試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

采用Design Expert（Version 8.0.6）對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，計(jì)算出回歸方程各系數(shù)，得到各個(gè)因素與楊梅果酒的酒精度Y1和總酯Y2多元二次回歸方程式：

由表5可知，楊梅果酒中酒精度和總酯檢驗(yàn)極顯著（p＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），說(shuō)明數(shù)據(jù)的相關(guān)度高，擬合性好。

表5 回歸檢驗(yàn)方差分析

接種量對(duì)楊梅果酒酒精度和總酯影響極顯著（p＜0.01），溫度影響為顯著（p＜0.05），SO2添加量的影響不顯著。影響因素主次順序?yàn)榻臃N量＞溫度＞SO2添加量。二次項(xiàng)的接種量、溫度、SO2添加量均極顯著（p＜0.01）。接種量與溫度的交互作用極顯著（p＜0.01），接種量與SO2添加量的交互作用顯著。

綜上所述，響應(yīng)面分析法優(yōu)化楊梅果酒酒精發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)為接種量0.3%、溫度24 ℃、SO2添加量55 mg/L、初始還原糖24 g/100 g、pH 3.8、多肽添加量4 g/L、發(fā)酵時(shí)間7 d。在此條件下，楊梅果酒的酒精度為12.7%vol，總酯含量為3.22 mg/L。

2.5 陳釀前后楊梅果酒中的甲醇及雜醇油對(duì)比

甲醇由果膠水解、甘氨酸脫羧反應(yīng)生成，有較強(qiáng)的毒性，經(jīng)消化道迅速吸收代謝產(chǎn)生甲酸和甲醛，損傷視覺(jué)和腦神經(jīng)細(xì)胞，嚴(yán)重可致失明[29]。雜醇油由發(fā)酵中氨基酸和蛋白質(zhì)降解代謝產(chǎn)生，以戊醇、丙醇、丁醇、苯乙醇、苯甲醇為主[30]。若雜醇油質(zhì)量濃度過(guò)高，則出現(xiàn)苦澀味，可引起頭痛等癥狀。目前我國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)尚未對(duì)果酒中的甲醇及雜醇油限定。葡萄酒中雜醇油質(zhì)量濃度一般在250～350 mg/L之間[31]。因此，可以此為參照對(duì)楊梅果酒進(jìn)行判定。通常果酒的陳釀期為90～180 d。

從表6可以看出，陳釀前酒體中均未檢出甲醇，雜醇油質(zhì)量濃度為290.37 mg/L，總量處于標(biāo)準(zhǔn)要求的水平，說(shuō)明酵母和酒精發(fā)酵工藝合理，發(fā)酵溫度高是產(chǎn)生甲醇和雜醇偏高的主要原因[32]。陳釀前異戊醇質(zhì)量濃度最高，為148.00 mg/L；異丁醇質(zhì)量濃度亦較高，為45 mg/L。異戊醇、異丁醇是由發(fā)酵的中間產(chǎn)物丙酮酸或乙醛生成的。酵母將酒中多的氨基酸轉(zhuǎn)化為高級(jí)醇，部分直接轉(zhuǎn)化為酯類(lèi)和有機(jī)酸，后期與高級(jí)醇反應(yīng)生成酯[30]。因此，通過(guò)陳釀，酒體中的雜醇油的質(zhì)量濃度進(jìn)一步降低，并可提高酒的柔爽性。陳釀60 d時(shí)，雜醇油由陳釀前的290.38 mg/L降至168.22 mg/L，降低42.07%，異戊醇由148 mg/L降低至84.02 mg/L，減少43.23%；其他醇相應(yīng)減小；陳釀至90 d時(shí)，雜醇油含量較陳釀至60 d時(shí)的相差很小，陳釀60 d和90 d的楊梅果酒酒質(zhì)柔爽、酒香濃郁，口感相差不大，明顯好于未陳釀的果酒。

3 結(jié)論

安琪酵母BV818的酒精發(fā)酵能力強(qiáng)，產(chǎn)朊假絲酵母CU-6的產(chǎn)酯能力好。當(dāng)BV818和CU-6體積比為1∶1時(shí)，酒體的酒精度和總酯質(zhì)量濃度均較高。楊梅汁中含氮量比較低，不足以提供酵母生長(zhǎng)的需要。利用大豆多肽補(bǔ)氮源，多肽為4 g/L適宜。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法確定楊梅果酒的酒精發(fā)酵工藝，當(dāng)初始還原糖24 g/100 g、初始pH 3.8、多肽4 g/L、接種量0.3%、溫度24 ℃、SO255 mg/L時(shí)，發(fā)酵7 d后楊梅果酒的酒精度可達(dá)12.5%vol、總酯質(zhì)量濃度為3.16 mg/L。采用氣相色譜法對(duì)陳釀前后的楊梅果酒中甲醇和雜醇油進(jìn)行測(cè)定分析，未檢出甲醇；陳釀60 d后果酒中雜醇油質(zhì)量濃度即可降至適當(dāng)?shù)乃剑铱诟小L(fēng)味皆好。