閃式提取法制備大葉千斤拔醇提物及其抑菌活性

熊建文，盧凱玲，陳正培，謝琳，韋鑫夢(mèng)

柳州工學(xué)院（柳州 545616）

大葉千斤拔（Flemingia macrophylla），又名大豬尾、千斤力、千金紅、紅藥頭和白馬屎等，是豆科千斤拔屬植物，為藥食同源植物，主要分布在我國(guó)廣西、廣東、海南、云南等地[1]。大葉千斤拔中含有多種結(jié)構(gòu)的化合物[2-4]，木質(zhì)部中含有5、7、2′、4′-四羥基異黃酮；樹皮中含有羽扇豆醇、α-香樹脂醇、谷甾醇、原矢車菊素、香豆素與谷甾醇葡萄糖苷；葉片及花萼中含有千斤拔色烯查耳酮C、D、E、F；根莖含有酰胺類、蒽醌類、揮發(fā)油類、黃烷酮類化合物[5-6]。其中，黃酮類物質(zhì)含量最高的化合物為染料木素和染料木苷。在生物活性方面的研究初步表明大葉千斤拔提取物具有消炎、鎮(zhèn)痛，免疫增強(qiáng)，促進(jìn)周圍神經(jīng)，感覺(jué)神經(jīng)損傷修復(fù)，類神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)腦組織和血腦屏障有保護(hù)等作用[7]，分離得到的黃酮類化合物具有抗炎癥[8-9]，抗氧化[10-11]，抗腫瘤[12-13]，抗微生物和類荷爾蒙活性等作用[14-15]。目前對(duì)大葉千斤拔醇提物的抑菌活性的研究很少，并且對(duì)不同方法制備的醇提物進(jìn)行生物活性的研究尚未見報(bào)道。此次試驗(yàn)以大葉千斤拔染料木素的得率為指標(biāo)，對(duì)大葉千斤拔的醇提工藝進(jìn)行研究和優(yōu)化，并對(duì)不同方法制備的大葉千斤拔醇提物抑菌活性進(jìn)行研究，將為大葉千斤拔醇提物的下一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大葉千斤拔藥材（廣西藥用植物園提供）；超純水（凈水器凈化而成）；染料木素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)生物藥品制品檢定所，批號(hào)：13080816）；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、真菌有啤酒酵母（Saccharomyces carlsbergensis）、黑曲霉（Aspergillus niger）菌種，柳州工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，馬鈴薯培養(yǎng)基，YPD培養(yǎng)基；甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸、無(wú)水乙醇等國(guó)產(chǎn)分析純；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、牛肉膏、蛋白胨等生物試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

島津LC-20A高效液相色譜儀（島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司）；ME104型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）；閃式提取儀（上海元析儀器有限公司）；UV-2600紫外分光光度計(jì)（島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZXRD-7080全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥烘箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；ZHJH-1112C垂直流超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大葉千斤拔藥材的預(yù)處理

大葉千斤拔（包含莖、葉）曬干后用剪刀剪成小段，放進(jìn)攪拌器里進(jìn)行粉碎，過(guò)0.250 mm粒徑篩待用。將粉碎完的藥材粉末用密封袋干燥保存待用。

1.3.2 醇提取物中染料木素的含量測(cè)定

1.3.2.1 染料木素標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精密稱取0.008 0 g染料木素標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜甲醇溶解，定容于10 mL棕色容量瓶中，充分搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的染料木素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2.2 色譜條件選擇

按照蔡錦源等[16]的測(cè)定方法，設(shè)置色譜條件，采用自動(dòng)進(jìn)樣器。精密吸取1 μL染料木苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，5 μL大葉千斤拔樣品溶液。染料木素的理論塔板數(shù)＞5 000，與相鄰的色譜峰分離度＞1.5，樣品中染料木素色譜峰能與其他色譜峰達(dá)到基線分離。

1.3.2.3 染料木素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精密吸取1 mL 1.3.2.1小節(jié)配制好的染料木素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用色譜純甲醇稀釋，定容于10 mL棕色容量瓶中，即可得到稀釋的待測(cè)染料木素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，溶液濃度為每毫升中含有0.08 mg染料木素。用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，待用。設(shè)置高效液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器，每次分別進(jìn)樣1，3，5，7，9和11 μL，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，即得到線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=40 915.06x+295.21，R2=0.999 8，表明染料木素標(biāo)準(zhǔn)品溶液在0.08～0.88 μg內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.2.4 染料木素含量的測(cè)定

將不同提取方法得到的提取液用上所述HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，染料木素得率按式（1）進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 閃式提取法的優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

采用閃式提取器，精準(zhǔn)稱取1 g大葉千斤拔樣品粉末，置于提取罐中，分別選取提取時(shí)間（1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 min）、液料比（10∶1，20∶1，30∶1，40∶1和50∶1 mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%，40%，50%，60%和70%）3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察這3個(gè)因素對(duì)大葉千斤拔染料木素得率的影響。

1.3.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)表L9(34)，對(duì)大葉千斤拔染料木素閃式提取工藝的主要影響因素進(jìn)行正交因素與水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平表見表1。

表1 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平表

1.3.4 提取方法

1.3.4.1 加熱回流法

按照牛迎鳳等[17]的加熱回流法最優(yōu)提取工藝，取大葉千斤拔樣品粉末，精準(zhǔn)稱取3份，每份1 g置于25 mL圓底燒瓶中，加入20 mL、80%乙醇，稱定并記錄質(zhì)量，在80 ℃的溫度下，水浴回流提取3.5 h，靜置至室溫，補(bǔ)足揮發(fā)的乙醇，搖勻后用普通定性濾紙過(guò)濾，濾液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，在避光處保存待用。

1.3.4.2 滲漉提取法

參照海莉等[18]的滲漉提取法，在滲漉筒底部放一層棉花，然后再覆蓋一張濾紙，精準(zhǔn)稱取3份大葉千斤樣品粉末，每份3 g置于滲漉瓶中，加入100 mL、80%乙醇溶液置于筒內(nèi)，慢慢讓其滲透浸濕，靜置72 h后，打開上下溶劑閥門開始滲漉，控制滲漉液流速在每分鐘流出20滴左右，收集濾液，濾液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，在避光處保存待用。

1.3.4.3 超聲波提取法

按照莫曉寧等[19]的超聲波提取的最優(yōu)工藝，取大葉千斤樣品粉末，精準(zhǔn)稱取3份，每份1 g，置于錐形瓶中，加入35 mL的90%乙醇溶液，超聲頻率200 W，提取時(shí)間15 min，收集濾液，濾液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，在避光處保存待用。

1.3.4.4 閃式提取法

按照1.3.3閃式提取法優(yōu)化后的最優(yōu)工藝，取大葉千斤拔樣品粉末，精準(zhǔn)稱取3份，每份1 g，置于提取罐中，加入30 mL的50%乙醇溶液，提取時(shí)間2.5 min，收集濾液，濾液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，在避光處保存待用。

1.3.5 抑菌試驗(yàn)

根據(jù)熊建文等[20]的濾紙片瓊脂擴(kuò)散法稍作修改后做抑菌試驗(yàn)。向滅菌好的培養(yǎng)皿中倒入一定量的瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，加入100 μL菌液，均勻涂布后，于37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱（30 ℃霉菌培養(yǎng)箱）中靜置30 min。將濾紙片（?=6 mm）進(jìn)行滅菌，在濾紙片上加入10 μL大葉千斤拔提取物，以10 μL對(duì)應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為陰性對(duì)照，用10 μL 3 mg/mL苯甲酸鈉作為陽(yáng)性對(duì)照。然后置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（細(xì)菌36～37 ℃，18～24 h；真菌28～30 ℃，48～72 h），觀察并通過(guò)十字交叉法記錄抑菌圈大小。以上步驟均按無(wú)菌條件操作，每樣品設(shè)3個(gè)平行樣，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)染料木素得率的影響

由圖1可知，液料比不斷增大時(shí)，染料木素得率也增大，在液料比為30∶1（mL/g）時(shí)染料木素得率最高，繼續(xù)增大，染料木素得率反而開始下降。原因可能是適當(dāng)增大液料比有利于提高染料木素得率，但是繼續(xù)加大液料比，閃式提取器對(duì)植物細(xì)胞的剪切和破壞效果減弱，導(dǎo)致染料木素溶出較少，使得染料木素得率降低，故液料比以30∶1（mL/g）為佳。

圖1 液料比對(duì)染料木素得率的影響

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)染料木素得率的影響

由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)不斷增加時(shí)，染料木素得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先增大后減小，并在50%時(shí)達(dá)到最大值。原因是可能隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)胞的溶漲增大，乙醇溶液向細(xì)胞內(nèi)部滲透增大，有效提高了得率，乙醇的體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，溶劑極性越來(lái)越低，除染料木素外的其他物質(zhì)提取率增大，反而影響染料木素的提取，故乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%為佳。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)染料木素得率的影響

2.1.3 不同提取時(shí)間對(duì)染料木素得率的影響

從圖3不同提取時(shí)間對(duì)染料木素的影響中可以看到，隨著提取時(shí)間的增加，染料木素得率先升高再降低，在2.5 min時(shí)染料木素得率最高。原因可能是隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，閃式提取器對(duì)植物細(xì)胞的剪切和破壞效果增大，使得染料木素的得率增加。但是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致化合物結(jié)構(gòu)被破壞，從而使得染料木素得率降低，故提取時(shí)間以2.5 min為宜。

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)染料木素得率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

按表1的因素和水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果如表2正交試驗(yàn)結(jié)果所示。由表2可看出，不同因素對(duì)閃式提取工藝的影響順序?yàn)锳＞B＞C，最優(yōu)工藝組合為A2B2C2，即液料比30∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間2.5 min。由表3正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析可知，A和B對(duì)結(jié)果有顯著影響，而C對(duì)結(jié)果無(wú)顯著影響。按最優(yōu)工藝條件分別進(jìn)行3次提取試驗(yàn)，染料木素的平均得率為0.51 mg/g，表明試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)穩(wěn)定、可行。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析

2.3 不同方法制備大葉千斤拔醇提物的比較

對(duì)采用不同方法制備的大葉千斤拔醇提物進(jìn)行染料木素得率的測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。可以看出，熱回流法的得率為0.38 mg/g，滲漉提取法的得率為0.21 mg/g，超聲波提取法的得率為0.42 mg/g，閃式提取法的得率為0.51 mg/g。比較4種方式，閃式提取法的得率最高，閃式提取法具有獨(dú)特的物理特性，能促使植物組織快速破碎或變形，便于有效成分提取分離。

圖4 提取方法對(duì)大葉千斤拔醇提物的影響

2.4 大葉千斤拔醇提物的抑菌作用

從表4中可以看出，大葉千斤拔醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和啤酒酵母有一定的抑菌效果，對(duì)黑曲霉基本沒(méi)有抑制效果。從制備方法上分析，閃式法制備的醇提物抑菌效果：金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞大腸肝菌＞釀酒酵母；超聲波制備的醇提物抑菌效果：大腸肝菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞釀酒酵母；熱回流制備的醇提物抑菌效果：金黃色葡萄球菌＞大腸肝菌＞枯草芽孢桿菌＞釀酒酵母；滲漉制備的醇提物抑菌效果大小排序與超聲波相同，但整體效果較差，對(duì)釀酒酵母和黑曲霉基本沒(méi)有抑制作用。

表4 不同方法制備的大葉千斤拔醇提取的抑菌效果

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用閃式提取法制備大葉千斤拔醇提物，通過(guò)單因素試驗(yàn)法和正交試驗(yàn)法系統(tǒng)研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液料比3個(gè)因素對(duì)大葉千斤拔染料木素的得率的影響，得出閃式提取法最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間2.5 min、液料比30∶1（mL/g），在此條件下染料木素得率為0.51 mg/g。對(duì)提取因素的試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比是提取試驗(yàn)的顯著因素，提取時(shí)間對(duì)提取試驗(yàn)的影響相對(duì)最小。

對(duì)超聲波、熱回流、滲漉和閃式4種提取方法的最優(yōu)工藝進(jìn)行考察和比較，熱回流法的得率為0.38 mg/g，滲漉提取法的得率為0.21 mg/g，超聲波提取法的得率為0.42 mg/g，閃式提取法得率最高，為0.51 mg/g。閃式提取法提取時(shí)間短，不需要加熱，節(jié)約能源，有效物提取率高，是一種高效快速的提取方法，近年來(lái)在天然產(chǎn)物的提取工藝中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

大葉千斤拔的醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和啤酒酵母有一定的抑菌效果，但對(duì)黑曲霉基本沒(méi)有抑制效果。可能是醇提物中存在一些黃酮類物質(zhì)，它們通過(guò)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，影響細(xì)菌和真菌DNA的復(fù)制與合成、蛋白質(zhì)的合成等，也可以通過(guò)破壞菌體的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)來(lái)抑制菌體呼吸進(jìn)而達(dá)到抑菌效果。不同方法制備的大葉千斤拔醇提物對(duì)幾種微生物的抑制作用不同，可能是由于不同的提取方式對(duì)活性成分的析出有偏好，導(dǎo)致醇提物中的活性成分存在一定的差異，需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)試驗(yàn)來(lái)研究。