一種藻藍(lán)蛋白衍生物的制備及穩(wěn)定性

鄭守晶，楊夢(mèng)琴，鄭明鋒

1.福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院（福州 350002）；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院（福州 350002）

藻藍(lán)蛋白（phycocyanin，PC），其熒光發(fā)射峰為615～640 nm[1-2]，是一種天然無(wú)毒的色素蛋白復(fù)合體，也是我國(guó)GB 2760—2014《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的僅有的兩種天然藍(lán)色素之一[3]，其生理功能豐富[4]，被廣泛應(yīng)用于食品和化妝品中[5]。藻藍(lán)蛋白通過(guò)硫鏈鍵結(jié)合四吡咯化合物、脫輔蛋白和α、β兩個(gè)亞基[6]。1個(gè)四吡咯環(huán)輔基以共價(jià)鍵形式結(jié)合在肽鏈上[7]。三聚體和六聚體是藻藍(lán)蛋白亞基的主要存在形式，少數(shù)有二聚體或聚集度更高的聚集體。藻藍(lán)蛋白的存在形式受到離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)濃度、pH、輻射、光照強(qiáng)度和光照時(shí)間等因素的影響[8]。藻藍(lán)蛋白中的四吡咯類色素與葉綠素、血紅素中的四吡咯類色素的主要結(jié)構(gòu)區(qū)別在于：葉綠素卟啉環(huán)中含有一個(gè)鎂原子，血紅素卟啉環(huán)中含有一個(gè)鐵原子，而藻藍(lán)蛋白卟啉環(huán)中有一個(gè)鎳原子[9]。

目前關(guān)于藻藍(lán)蛋白衍生物的研究較少，以鈣離子替代卟啉環(huán)中心原子鎳，獲得藻藍(lán)蛋白衍生物，并研究其穩(wěn)定性，使其功效進(jìn)一步擴(kuò)大，既可以作為食品添加劑應(yīng)用于食品中，還能作為功能性成分應(yīng)用于生物醫(yī)藥方面，具有極大的開(kāi)發(fā)潛力。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

藻藍(lán)蛋白（西安澤邦生物科技有限公司）；CaCO3、HCl、NaOH 、H2O2等均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

UV-5500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海亞研電子公司）；W201恒溫水浴鍋（上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器公司）；L550臺(tái)式離心機(jī)（上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藻藍(lán)蛋白衍生物制備

配制100 mL 1%藻藍(lán)蛋白溶液，以1∶30（g/mL）的料液比加入CaCO3，于50 ℃水浴浸提1.0 h，離心（3 000 r/min）10 min取上清液，測(cè)定其在300～700 nm范圍內(nèi)的吸光度，繪制光譜掃描曲線。

1.3.2 藻藍(lán)蛋白衍生物的提取單因素試驗(yàn)

在制備藻藍(lán)蛋白衍生物的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，浸提液中很少含有最大吸收峰區(qū)的干擾物質(zhì)，因此試驗(yàn)采用吸光度A579的大小來(lái)衡量衍生物中色素含量的多少。

1) 溫度：配制100 mL 1%藻藍(lán)蛋白溶液，以1∶30（g/mL）的料液比加入CaCO3，分別在不同溫度（30，40，50，60和70 ℃）條件下水浴浸提1.0 h，然后3 000 r/min離心10 min，取藍(lán)色上清液[10]，再分別測(cè)定藻藍(lán)蛋白衍生物溶液的吸光度A579。

2) 提取時(shí)間：配制100 mL 1%藻藍(lán)蛋白溶液，以1∶30（g/mL）的料液比加入CaCO3，于50 ℃水浴，分別浸提1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 h，然后3 000 r/min離心10 min，取藍(lán)色上清液，再分別測(cè)定藻藍(lán)蛋白衍生物溶液的吸光度A579。

3) 料液比：CaCO3以1∶80，1∶90，1∶100，1∶110和1∶120（g/mL）的料液比在50 ℃水浴浸提2.5 h，然后3 000 r/min離心10 min，取藍(lán)色上清液，再分別測(cè)定藻藍(lán)蛋白衍生物溶液的吸光度A579。

1.3.3 藻藍(lán)蛋白衍生物單因素正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）和料液比（C）為因素，以吸光度A579為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 藻藍(lán)蛋白衍生物提取試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 藻藍(lán)蛋白衍生物穩(wěn)定性影響

采用最佳提取工藝制備衍生物提取液，并避光冷藏于4 ℃條件下備用，參考張巖等[11]、曹竑等[12]的方法，考察溫度（40，50，60和70 ℃）、光照（室內(nèi)自然光下儲(chǔ)藏1，2，3和4 d）、pH（NaOH調(diào)節(jié)pH為4～10）、氧化劑（H2O2濃度分別為1%，2%，3%，4%和5%）以及常用食品添加劑（分別添加1%，2%，3%，4%和5%的葡萄糖、蔗糖和檸檬酸）這些因素對(duì)衍生物提取液穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻藍(lán)蛋白及衍生物的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜

在300～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，分別用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)藻藍(lán)蛋白水溶液和衍生物溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果分別如圖1（a）和圖1（b）所示。由圖1（a）可知，藻藍(lán)蛋白水溶液光譜最大吸收峰為620 nm左右，與李建宏等[13]的研究一致；而圖1（b），其可見(jiàn)光范圍內(nèi)最大吸收峰在579 nm。對(duì)比圖1（a）和圖1（b）可知，最大吸收峰產(chǎn)生了位移。藻藍(lán)素發(fā)色基團(tuán)是影響藻藍(lán)蛋白的吸收光譜主要因素，藻藍(lán)蛋白衍生物在波長(zhǎng)579 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，說(shuō)明藻藍(lán)蛋白發(fā)色基團(tuán)的光譜學(xué)特性發(fā)生改變，可推斷產(chǎn)生了與天然藻藍(lán)蛋白不同的衍生物質(zhì)[14]。

圖1 藻藍(lán)蛋白溶液及衍生物溶液光譜掃描曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物的影響

由圖2（a）可知，藻藍(lán)蛋白衍生物溶液的吸光度，隨著溫度的升高，先增加后降低；當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)，溶液的吸光度最高?？赡苁且?yàn)楫?dāng)溫度超過(guò)藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定溫度后，由于蛋白質(zhì)的熱變性作用導(dǎo)致其空間構(gòu)象的改變，從而改變發(fā)色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)[15]，導(dǎo)致吸光度的下降，因此反應(yīng)溫度選擇50 ℃。

由圖2（b）可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于2.5 h時(shí)，衍生物溶液的吸光度變化不明顯，可能是反應(yīng)不夠充分。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到3.0 h時(shí)，吸光度最高；之后又呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，因此反應(yīng)時(shí)間確定為3.0 h。

由圖2（c）可知，當(dāng)料液比為1∶100（g/mL），藻藍(lán)蛋白與CaCO3充分接觸反應(yīng)，吸光度最大。料液比繼續(xù)增加，吸光度減小，所以料液比選擇1∶100（g/mL）。

圖2 單因素對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物吸光度的影響

2.3 藻藍(lán)蛋白衍生物正交試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，安排L9(34)正交試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析和方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 正交設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果

由表2可知，影響衍生物溶液吸光度的主次因素為反應(yīng)溫度＞料液比＞反應(yīng)時(shí)間，其最優(yōu)組合為A2B3C1，即反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時(shí)間為3.0 h、料液比為1∶80（g/mL）。由表3可知，可知反應(yīng)溫度對(duì)吸光度有顯著影響，反應(yīng)時(shí)間和料液比對(duì)吸光度無(wú)顯著影響，與極差分析結(jié)果一致。對(duì)該反應(yīng)條件進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)得其吸光度為0.330，略優(yōu)于正交試驗(yàn)中的組合。

2.4 各因素對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

2.4.1 溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

溫度會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。由圖3可知，當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，藻藍(lán)蛋白衍生物的吸光度基本保持不變。當(dāng)溫度升高到60 ℃時(shí)，衍生物的熱穩(wěn)定性降低，故吸光度呈明顯下降趨勢(shì)。另外在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，只需加熱0.5 h，溶液就變?yōu)榈仙?。因此，衍生物溶液?chǔ)存溫度不高于40 ℃，熱穩(wěn)定性較好。

圖3 溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

2.4.2 光照對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，藻藍(lán)蛋白衍生物溶液光照4 d，在黑暗條件下吸光度基本保持穩(wěn)定；在自然光照射條件下，藻藍(lán)蛋白衍生物吸光度變化較大，說(shuō)明光照對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物有一定的影響，在使用時(shí)應(yīng)避光保存。

圖4 光照對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

2.4.3 pH對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物的影響

pH會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的解離程度及所帶電荷性質(zhì)產(chǎn)生影響。由表4可知，藻藍(lán)蛋白衍生物吸光度隨著pH增加，溶液顏色由深變淺至無(wú)色。pH在5～7范圍內(nèi)，顏色穩(wěn)定，吸光度變化較小；pH在8～10范圍內(nèi)吸光度減小，溶液褪色；pH為7時(shí)吸光度最大，故儲(chǔ)存條件應(yīng)為近中性，其穩(wěn)定性最好。

表4 pH對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

2.4.4 氧化劑對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物的影響

由圖5可知，隨著氧化劑H2O2濃度的增大，吸光度呈下降趨勢(shì)，且藻藍(lán)蛋白衍生物溶液顏色由藍(lán)紫色褪色成無(wú)色，說(shuō)明藻藍(lán)蛋白衍生物對(duì)抗氧化性較差，在使用時(shí)應(yīng)盡量避免與氧化性物質(zhì)接觸。

圖5 H2O2對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

2.4.5 常用添加劑對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物的影響

葡萄糖、蔗糖、檸檬酸是食品加工中常用的添加劑。由圖6可以看出，隨著葡萄糖和蔗糖濃度的增加，衍生物的吸光度得到提高，這可能是因?yàn)槠咸烟恰⒄崽堑募尤肫鸬搅俗o(hù)色效果[16]。蔗糖雖然也能起到護(hù)色效果，但不如葡萄糖顯著。隨著檸檬酸濃度的增加，衍生物產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致吸光度降低。因此在使用過(guò)程中，應(yīng)避免和檸檬酸同用。

圖6 食品添加劑對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

以藻藍(lán)蛋白為原料，制備其衍生物，并進(jìn)行衍生物穩(wěn)定性研究。結(jié)果表明：碳酸鈣與藻藍(lán)蛋白反應(yīng)后的藻藍(lán)蛋白衍生物溶液呈藍(lán)紫色，在可見(jiàn)光范圍內(nèi)最大吸收波長(zhǎng)為579 nm。衍生物最佳的反應(yīng)條件是反應(yīng)溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間3.0 h、料液比1∶100（g/mL）。該衍生物儲(chǔ)存溫度應(yīng)不高于40 ℃，在近中性、避光條件保存。在食品加工中，葡萄糖和蔗糖可對(duì)其產(chǎn)生增色效果，應(yīng)盡量避免與氧化性物質(zhì)、檸檬酸共同使用。

對(duì)藻藍(lán)蛋白衍生物的制備進(jìn)行了初步研究，后續(xù)可對(duì)衍生物中藻藍(lán)素的提取等方面開(kāi)展進(jìn)一步研究，為其應(yīng)用提供更多參考價(jià)值。