超高壓處理對熱鮮豬肉中乳酸的影響

張慧娟，潘見

1.廣東力泰德食品工程有限公司（佛山 528225）；2.合肥工業大學農產品生物化工教育部工程研究中心（合肥 230009）

乳酸是肌肉組織內的糖類代謝產物[1]。動物屠宰后，要經歷成熟過程，期間肌肉中的糖原先水解成葡萄糖，再經過無氧酵解變成乳酸，糖酵解過程生成的乳酸不再像活體動物那樣被轉運到肝臟中而后合成肝糖原或通過血液循環而被排除到體外，而是在肌肉細胞內蓄積起來，導致pH的下降[2-3]。同時，乳酸的大量生成會造成冷卻肉的保水性及嫩度不同程度下降，這與PSE（pale，soft and exudative）肉和DFD（dark，firm and dry）肉的產生有密切關系[4]。因此乳酸含量對肉的品質影響尤為重要。

超高壓能夠抑制新鮮豬肉的僵化過程[5]，超高壓技術的應用未來可能替代傳統的吊掛排酸，為肉制品的加工提供新的方法。已有眾多學者對超高壓技術在肉中的應用做了大量的探索[6-8]，但超高壓對豬肉中乳酸含量的影響尚未見報道。通過探索超高壓對肉中乳酸含量的影響，并探索其變化的機理，以期為超高壓技術在肉品工業上的應用提供方法的完善與創新。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬腰肉（合肥市周谷堆農貿市場）；乳酸標樣（純度99.9%，Sigma公司）；輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）（百靈威上海公司）；乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）（Promega公司）；牛磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶酶聯免疫分析試劑盒（上海遠慕生物科技有限公司）；甲醇（國產色譜純，生工生物工程（上海）股份有限公司）；高氯酸（國產優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸二氫銨、磷酸、乙酸鈉、氫氧化鈉（國產分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；D-甘露糖醇（D-mannitol）、Tris-base（美國Amresco公司）；乙二胺四乙酸（EDTA）、二硫蘇糖醇（dithiohthreitol，DTT）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）（Sigma公司）；NaF、焦磷酸鈉（天津永大化學試劑廠）；超純水（實驗室自制）；中速定量濾紙（杭州特種紙業有限公司）；0.45 μm一次性針頭微孔濾膜（江蘇漢邦科技有限公司）；1 mL針器注射器（江蘇治宇醫療器械有限公司）。

1.2 儀器與設備

1L超高壓系統（包頭科發科技有限公司）；Agilent 1260高效液相系統、Agilent C18（5 μm，Φ4.6 mm×250 mm）色譜柱（美國Agilent Technologies）；KH-1500SP超聲儀（昆山禾創超聲儀器有限公司）；FM200分散器（德國FLUKO公司）；3K15高速冷凍離心機（Sigma公司）；UV-1600紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；pH計（上海雷磁科學儀器有限公司）；BCD-220VM（E）冰箱（美的集團）；FC104電子分析天平（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 肉樣的準備

1.3.1.1 成熟肉樣的準備

樣品來源于當地屠宰場，1歲的皖北豬，每只體重為90～100 kg，按常規方法屠宰，之后在4 ℃下跟腱吊掛排酸24 h。吊掛結束后，從尸體中的腰部取出部分肉樣，并將這些肉樣平行于肌肉纖維切成大小為長8 cm×寬5 cm×高5 cm的小塊，分別用聚乙烯袋單獨真空包裝，之后儲存在-18 ℃冰箱中，直到進一步的使用。

1.3.1.2 超高壓肉樣的準備

從常規屠宰，未吊掛的、1歲、每只體重為90～100 kg的皖北豬尸體上取得腰肉樣品，共制備30個與1.3.1.1相同大小的樣本。每個樣品單獨用聚乙烯袋真空包裝，并立即進行超高壓處理。

肉樣在包裝后分別轉移到超高壓釜中。加壓介質為油，初始溫度20 ℃（±3 ℃）。試驗采取不同壓力處理（分別為100，200，300和400 MPa），處理時間為10 min，后儲存在-18 ℃冰箱中，用于進行下一步分析。壓力分別在3～5 MPa/s之間增加和減少。

未處理的樣品保留作為對照處理。超高壓肉樣的制備在屠宰后2 h內完成。

1.3.2 酶液準備

取適量的LDH，用100 mL生理鹽水溶解。再分別將10 mL酶液倒入聚乙烯袋中真空包裝，并立即進行超高壓處理（分別為100，200，300和400 MPa），然后儲存在4 ℃冰箱中。

未處理的樣品保留作為對照處理。

1.3.3 試驗方法

1.3.3.1 乳酸含量測定

1.3.3.1.1 色譜條件

參考朱學伸等[4]的方法，Agilent 1260 HPLC系統；Agilent C18（5 μm，Φ4.6 mm×250 mm）色譜柱；以甲醇與10 mmol/L磷酸二氫銨混合液為流動相，體積比為5∶95，配制前磷酸二氫銨用體積分數為50%的磷酸溶液調節pH至2.2，混合液在使用前經0.45 μm的合成纖維素膜真空抽濾并超聲脫氣；0.7 mL/min流速；25℃柱溫；20 μL進樣量；210 nm紫外檢測波長。

1.3.3.1.2 樣品前處理

參考Immonen等[9]的方法，從冰箱中取出樣品，稱取1.0 g肉樣，剪碎后放入離心管中，然后加入10 mL的1 mol/L高氯酸，并在13 500 r/min條件下勻漿30 s。后勻漿液在5 500 r/min、4 ℃條件下離心10 min，將上清液經定量濾紙過濾置于25 mL容量瓶中，濾渣用10 mL高氯酸洗滌，并轉移至離心管中，再次在13 500 r/min的條件下勻漿30 s，后再次用5 500 r/min、4 ℃的條件離心10 min，上清液經定量濾紙過濾，與前一次濾液合并轉入置于25 mL容量瓶中，并精準定容至25 mL。提取液在4 ℃條件下保存待檢測。檢測前提取液需過0.45 μm濾膜。

1.3.3.1.3 標準溶液配制及樣品測定

準確稱取100 mg乳酸標樣，用超純水定容至10 mL。然后用超純水逐級稀釋為20，40，60，80，200和250 μg/L的乳酸標準溶液。按照1.3.3.1的色譜條件進樣分析，每個質量濃度進樣3次。以乳酸質量濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

肉樣經1.3.1處理后，再按照1.3.3.1.2制得提取液，提取液按1.3.3.1.1的色譜條件測定。

1.3.3.2 酶活性測定方法

1.3.3.2.1 磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活性檢測

參照楊雅媛等[10]的方法并作修改，取0.5 g冷凍的肉樣，剪碎后置于離心管中，加入預冷的勻漿液（pH 7.4，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，5 mmol/L焦磷酸鈉，50 mmol/L NaF，0.05 mol/L Tris-HCl，0.25 mol/LD-甘露醇）冰浴勻漿（每12 s勻漿1次，間隙20 s，重復5次）。然后在10 000 r/min、4 ℃的條件下離心5 min，取上清液用于AMPK活力的測定。測定方法參照試劑盒進行。

1.3.3.2.2 LDH活性檢測

總反應體系包括 50 mmol/L、pH 5.5的乙酸鈉緩沖液，0.2 mmol/L NADH，5 mmol/L乳酸，對照組中不含NADH，其他成分相同。混勻后于30 ℃保溫5 min，加入適量的酶液。檢測在340 nm處的吸光度。

1.3.3.3 數據分析

試驗數據采用 Excel 進行統計，采用SPSS進行分析，對各個指標進行差異性分析時采用Duncan方法，當p＜0.05時，表明對其影響差異顯著。

2 結果與分析

2.1 超高壓處理對肉中乳酸含量的影響

此次測定的乳酸含量和峰面積之間的回歸方程為Y=1.252 5X+5.573 2，R2=0.997 2，由此表明當乳酸質量濃度在0～250 μg/mL范圍內時，乳酸質量濃度和峰面積之間線性良好。

不同處理條件，豬肉中的乳酸含量變化如圖1所示。與新鮮肉相比，壓力對豬肉中乳酸的變化顯著（p＜0.05）。

圖1 處理方法對豬肉中乳酸含量的影響

由圖1的結果可知，豬肉經過吊掛成熟過程后，肉中的乳酸含量有小幅度的上升，由原來的0.83 mg/g上升為0.95 mg/g，說明肉的成熟過程是產生乳酸的過程。

低于或等于200 MPa壓力的處理，肉中的乳酸含量降低，可能是低于或等于200 MPa壓力抑制了乳酸的生產。壓力在300～400 MPa范圍內，壓力的作用能夠引起乳酸含量的顯著變化，處理后豬肉中的乳酸含量明顯高于新鮮肉和成熟肉。當壓力從200 MPa升高到400 MPa時，乳酸含量持續增加，400 MPa肉中的乳酸含量達到最高，為5.18 mg/g。

Kijowski等[11]研究表明，乳酸能通過對肌原纖維和結締組織的弱化來改善肉的嫩度。在一定程度上，乳酸的抑菌作用可以顯著延長肉制品的貯藏期[12]。

正常情況下，乳酸的不斷生成，造成肉的pH不斷下降，乳酸生成速率下降。但此時乳酸短時間內形成大量堆積，究其原因還需從乳酸的產生機制討論。

豬肉中乳酸的產生路線如圖2所示。糖原被分解生成丙酮酸，在缺氧的條件下丙酮酸進一步被還原為乳酸。從圖中可以看出影響乳酸生成的直接因素為底物丙酮酸的含量和LDH的酶活大小。而丙酮酸的含量主要受糖酵解的影響。

圖2 豬肉中乳酸生成的線路圖

朱庸平[13]研究表明，在糖酵解產生乳酸的過程中，糖原是足夠的，直到豬肉徹底熟化，糖原仍有剩余，產生乳酸的多少與糖酵解潛力有關。在糖酵解過程中，相關限速酶活性是影響糖酵解進程的關鍵因素[14]。在這些糖酵解限速酶中，糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase）和磷酸果糖激酶（phosphofructokinase）活性可以被腺苷酸蛋白活化激酶調控[15]。AMPK活性被激活后，可以直接磷酸化糖酵解關鍵酶并提高其活性，進而促進糖酵解[16]。

在無氧條件下，糖酵解的中間產物丙酮酸在LDH的作用下發生脫羧和還原反應，其中還原劑是NADH，最終生成乳酸和氧化態的NAD+[17]。超高壓對乳酸含量的影響是否是因為超高壓對AMPK和LDH的影響，將做進一步的討論。

2.2 超高壓對AMPK活性的影響

AMPK是一個異源三聚體，由α、β和γ三種亞基組成，能被機體各種刺激激活[18]。酶分子有一級、二級、三級和四級結構，不同層次的結構對酶分子具有不同的意義。超高壓通過破壞蛋白質的二級、三級和四級結構的非共價鍵，而不影響一級結構的共價鍵，從而使酶失活或增活。二級結構也是僅在非常高的壓力下才會發生結構調整，三級和四級結構受到壓力的影響最大[19]。蛋白質結構的改變，造成了酶活大小的變化。

AMPK的活性高應該代表著糖酵解的速度也高[20]，那么丙酮酸的含量也將相應地提高，這將加快乳酸的生成。

壓力對AMPK活性的影響如圖3所示。與對照組相比，壓力對AMPK活性的影響顯著（p＜0.05）。

圖3 壓力對AMPK活性的影響

由圖3的結果可知，在壓力低于或等于200 MPa時，隨著壓力的升高，AMPK活性降低，但幅度較小，這說明，在此壓力區間，壓力對AMPK活性有一定的抑制作用。當壓力在200～400 MPa時，隨著壓力的升高，AMPK活性也顯著升高，且在400 MPa時達到最大值，這說明，較高的壓力改變了AMPK的結構，使AMPK被激活。

從圖2和圖1的對比可知，在壓力低于或等于200 MPa時，AMPK活性被抑制，降低了糖酵解的速度，進而降低了乳酸的生成；當壓力在200～400 MPa時，壓力越高，AMPK活性越大，糖酵解的速度越快，乳酸的積累越多。

2.3 超高壓對LDH活性的影響

LDH是一種參與新陳代謝的十分重要的蛋白酶，廣泛存在于植物、動物、原核生物中。它可以催化底物丙酮酸和乳酸的相互轉化。反應發生依賴于：NADH將H轉移給丙酮酸羰基的C原子，同時活性部位一個特定的已經質子化的組氨酸（histidine），將質子轉給丙酮酸羰基的O原子，丙酮酸在它的羰基方向上同時加上了兩個氫，變成了乳酸[21-22]。

壓力對LDH活性的影響見圖4。試驗期間超高壓處理后LDH活性與對照組有顯著性差異（p＜0.05）。在0～200 MPa壓力范圍，LDH活性隨壓力升高而有小幅度的降低，在200 MPa時，LDH活性為對照組的0.87倍。在200～300 MPa壓力范圍內，LDH活性隨壓力升高而升高，并在300 MPa時，活性達到最大，為對照組的1.97倍。在300～400 MPa壓力范圍內，LDH活性隨壓力升高而降低，在400 MPa時，LDH活性為對照組的1.58倍。

圖4 壓力對LDH活性的影響

基于這些結果得出以下結論：200～400 MPa的壓力處理能夠顯著提高LDH的活性，進而使得糖酵解產生的丙酮酸在LDH的作用下大量生產乳酸，使得乳酸得到積累。

3 結論

較未處理的新鮮豬肉，0～200 MPa壓力的處理，使得肉中的乳酸含量降低；300～400 MPa壓力的處理，豬肉中的乳酸含量明顯高于新鮮肉和成熟肉，并在400 MPa處理后，肉中的乳酸含量達到最高。

通過對乳酸產生機制中關鍵酶活的檢測，得到如下原因：

在壓力低于或等于200 MPa時，AMPK活性被抑制，降低了糖酵解的速度，同時LDH活性也有小幅度的降低，降低了乳酸的生成；當壓力在200～400 MPa時，壓力越高，AMPK活性越大，糖酵解的速度越快，在此壓力范圍內，LDH酶活處于激活狀態，促進了乳酸的積累。