響應面優化酶法制備高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽參數

蔡曉，戴凌燕，姜鵬，阮長青, ，張東杰, ，李志江, *

1.黑龍江八一農墾大學食品學院（大慶 163319）；2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院（大慶 163319）；3.黑龍江省雜糧加工及質量安全工程技術研究中心（大慶 163319）；4.國家雜糧工程技術研究中心（大慶 163319）

二肽基肽酶-IV（DPP-IV）抑制肽是一類具有促進胰島素分泌功能的生物活性肽，通過抑制DPP-IV對胰高血糖素樣肽-1和抑胃肽（GIP）在內的葡萄糖抑制多肽的降解，提高胰島素的分泌量[1]，被廣泛應用于Ⅱ型糖尿病的治療中。糖尿病是由代謝紊亂引起的慢性疾病[2]，表現為血糖水平過高，易引發中風、心肌梗死等問題，嚴重時會危及生命[3]。據國際糖尿病聯合會統計，在2017年底，糖尿病患者達到4.25億[4]，其中Ⅱ型糖尿病占95%以上[5]。目前，人工合成的DPP-IV抑制劑已推廣應用，如維達列汀、西格列汀等，但在降低血糖的同時也引發了腹瀉、過敏等副作用[6]。因此，開發天然、安全的DPP-IV抑制肽引起了重視，成為研究的熱點。

高粱是世界五大種植作物之一[7]。高粱具有產量高、耐貧瘠等優勢，使其在全世界均有大量的種植。高粱的蛋白質含量為6%～18%，由清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白組成[8]，醇溶蛋白占60%～80%[9]，含有大量疏水性氨基酸。有研究表明DPP-IV抑制肽通常具有高比例的疏水性氨基酸，疏水性氨基酸可能會加強與DPP-IV活性位點的相互作用[10]。因此，從高粱醇溶蛋白水解物中獲得DPP-IV抑制肽，成為開發糖尿病藥物的新方向。

由于高粱醇溶蛋白的消化性較差，近年來對高粱醇溶蛋白的研究主要以生物膜制備[11]及包埋荷載能力[12-13]為方向，制備生物活性肽的相關研究較少，其中制備抗氧化活性肽的研究較為活躍[14-15]，但制備DPP-IV抑制肽的相關研究尚無報道。研究利用木瓜蛋白酶，優化制備高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽的最佳工藝參數，為高粱醇溶蛋白的開發與利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料和試劑

高粱，龍米糧1號（蛋白質含量9.2%），黑龍江省農業科學院作物育種研究所王黎明研究員饋贈；木瓜蛋白酶（酶活800 U/mg）、堿性蛋白酶（酶活200 U/mg）、風味蛋白酶（酶活30 U/mg）、牛血清白蛋白，索萊寶科技有限公司；中性蛋白酶（酶活100 U/mg），源葉生物科技有限公司；二肽基肽酶IV、甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺對甲苯磺酸鹽，Sigma公司；Folin-酚試劑，北京鼎國生物科技有限公司；乙醇、石油醚等有機溶劑，分析純，沈陽試劑廠。

1.1.2 儀器與設備

Varioskan Flash酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；CHRISTALpha型冷凍干燥機，CHRIST公司；PHS.2C型精密pH計，美國METTLER TOLEDO公司；Cary60分光光度計，美國安捷倫公司；AB204-N型分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；SENCO恒溫水浴鍋，上海申生科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 高粱醇溶蛋白的制備

取粉碎后的高粱，按1∶5的比例加石油醚進行脫脂，再將100 g脫脂高粱粉在65 ℃下，加入900 mL含有0.3 g偏亞硫酸氫鈉的體積分數70%含水乙醇提取1 h，期間通過自動攪拌器不斷攪拌。在3 300g，15 min條件下離心，取上清液。將溶劑稀釋至體積分數40%乙醇水溶液并在4 ℃保持過夜以促進蛋白質沉淀[16]。在上述條件下離心后回收蛋白質沉淀，進行冷凍干燥，于-80 ℃儲存備用。

1.2.2 高粱醇溶蛋白酶解物的制備

將1 g高粱醇溶蛋白溶解于裝有25 mL去離子水的錐形瓶中，制備出蛋白質懸浮液（質量分數4%）。向懸浮液中添加蛋白酶，用橡膠塞密封燒瓶。預熱至酶解溫度后，轉移到水浴搖床中[17]。反應結束后，于95 ℃水浴15 min滅酶，冷卻至室溫。用離心機按3 500g離心25 min，收集上清液，即為水解產物。

1.2.3 最適用酶的篩選

試驗共選用4種蛋白酶酶解高粱醇溶蛋白，其最適作用條件如表1所示。通過改變酶解時間，測定高粱醇溶蛋白酶解液的DPP-IV抑制率，比較4種酶的酶解情況，確定最適用酶對其工藝條件進行優化。

表1 不同蛋白酶酶解的用量及反應條件

1.2.4 DPP-IV抑制率的測定

通過底物發色法對DPP-IV抑制率進行測定[18]。將試驗分為4組，分別為陰性對照組（酶10 μL+緩沖液40 μL+底物50 μL）、空白對照組（底物50 μL+緩沖液50 μL）、試驗組（酶解液40 μL+酶10 μL+底物50 μL）和試驗空白對照組（酶解液40 μL+緩沖液10 μL+底物50 μL）。反應在96孔板內進行，DPP-IV質量濃度為100 ng/mL，發光底物甘氨酰-脯氨酰-對硝基苯胺對甲苯磺酸鹽濃度為100 μmol/L，所用溶解液為100 mmol/L Tris-buffer緩沖液（pH 8.0）[19]。按照酶解液、蛋白酶、緩沖液、底物的順序依次加入后，在37 ℃下預熱1 h，在405 nm處測定吸光度，根據式（1）計算抑制率[20]。

式中：ΔA0為陰性對照組吸光度-空白對照組吸光度；ΔAx為試驗組吸光度-試驗空白對照組吸光度。

1.2.5 可溶性蛋白含量的測定

在試管中加入1 mL待測樣品（稀釋后），再加入5 mL Folin-酚試劑甲，室溫下靜置10 min，加入0.5 mL Folin-酚試劑乙，搖勻，室溫下靜置30 min，在500 nm條件下測定吸光度。空白以1 mL蒸餾水代替，其余操作相同。將測定的吸光度代入標準曲線方程，計算其蛋白濃度[21]。

1.2.6 單因素試驗

酶解時間的確定。選用木瓜蛋白酶，按1.2.2節的方法進行酶解。將酶解時間控制在1，2，3，4，5和6 h，在溫度50 ℃，pH 6.5，酶添加量6 000 U/g條件下酶解。

酶解溫度的確定。選用木瓜蛋白酶，按1.2.2節的方法進行酶解。將酶解溫度控制在40，45，50，55和60 ℃，在時間3 h，pH 6.5，酶添加量6 000 U/g條件下酶解。

pH的確定。選用木瓜蛋白酶，按1.2.2節的方法進行酶解。將酶解pH控制在5，5.5，6，6.5和7，在時間3 h，溫度50 ℃，酶添加量6 000 U/g條件下酶解。

加酶量的確定。選用木瓜蛋白酶，按1.2.2節的方法進行酶解。將加酶量控制在3 000，6 000，9 000，12 000和15 000 U/g，在時間3 h，溫度50 ℃，pH 5.5條件下酶解。

1.2.7 酶解工藝優化

根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，基于單因素試驗結果，以酶解時間（A）、溫度（B）、pH（C）、酶添加量（D）為響應因素，酶解液DPP-IV抑制率（Y）為響應值，采用四因素三水平的響應面分析法進行試驗設計，因素和編碼水平見表2。結果運用Design-Expert.V 8.0.6軟件進行數據處理和響應曲面分析。

表2 響應面試驗的因素及水平設計

1.3 統計分析

所有指標檢測均選取3次結果取平均值。所得數據采用SPSS 25軟件進行數據統計分析，以α=0.05和α=0.01作為差異顯著水平，結果用X±SD表示。若有顯著性差異（p＜0.05），則采用Duncan進行多重比較檢驗。用Graph Pad Prism作圖軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 高粱DPP-IV肽水解酶的篩選

分別對比了4種蛋白酶水解高粱醇溶蛋白水解產物的DPP-IV抑制效果，結果如圖1所示。測定了4種蛋白酶酶解液DPP-IV抑制率，其中木瓜蛋白酶酶解的酶解液DPP-IV抑制率最大。蛋白酶對水解底物的專一性表現在各種蛋白酶作用位點的不同，這可能使4種蛋白酶水解高粱醇溶蛋白后，產生具有明顯差異的組成和特性的酶解產物[22]。因此，蛋白酶解液顯示出DPP-IV抑制活性差異明顯的現象。

圖1 4種水解酶處理不同水解時間得到水解樣品的DPP-IV抑制率

2.2 高粱醇溶蛋白酶解單因素條件研究

2.2.1 不同時間梯度對酶解產物DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量的影響

測定在不同的酶解時間下高粱醇溶蛋白水解產物的DPP-IV抑制效果和可溶性蛋白含量的變化，結果見圖2。當酶解時間為1～3 h時，隨著酶解時間的延長，DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量均以較快速率遞增，伴隨酶解時間的不斷延長，在達到3 h時，酶解產物的DPP-IV抑制活性為73.67%。隨后在3～6 h時間段內，隨著酶解時間的延長，DPP-IV抑制活性的變化趨勢基本穩定，表現為緩慢增長后下降，無顯著性差異（p＞0.05）。可溶性蛋白含量的變化也與DPP-IV抑制活性的變化趨勢同步，表現為緩慢增加，無顯著性差異（p＞0.05）。甲承立[23]在使用胰蛋白酶酶解乳白蛋白制備DPP-IV抑制肽時發現，隨著酶解時間的積累，乳白蛋白酶解產物的DPP-IV抑制活性呈現出先升高后緩慢下降，在出現拐點的位置達到最佳抑制活性，因此該時間點為最優水解時間。出現拐點后DPP-IV抑制活性略有下降的原因，可能是伴隨酶活力的下降以及加熱時間的延長，水解產物中肽段出現了重新聚合現象，導致最終產物中的有效成分減少。這是由于酶解反應啟動后，伴隨時間延長，蛋白質水解生成的短鏈多肽含量增多，活性肽的抑制活性和可溶性蛋白含量也隨之增大。當活性達到最大值后，隨著酶解反應的繼續，蛋白質水解成的短鏈多肽會進一步水解，可能產生小部分氨基酸，抑制肽的數量就會隨之減少。試驗考慮到在3 h后DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白均無顯著性差異（p＞0.05），故直接選擇3 h為最佳酶解時間進行后續試驗。

圖2 時間對酶解產物DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白的影響

2.2.2 不同溫度梯度對酶解產物DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量的影響

測定在不同的溫度條件下高粱醇溶蛋白水解產物的DPP-IV抑制效果和可溶性蛋白含量的變化，結果如圖3所示。當酶解溫度在40～50 ℃范圍內變化時，可溶性蛋白含量和DPP-IV抑制率表現出遞增趨勢。當酶解溫度升高至50 ℃時，DPP-IV抑制率達到最大值。在50～60 ℃，伴隨著溫度的上升，DPP-IV抑制率呈下降趨勢，可溶性蛋白含量則是逐漸趨于穩定。吉薇等[24]通過響應面優化法確定動物蛋白酶水解南極磷蝦制備DPP-IV抑制肽的最佳酶解工藝，其中，溫度對酶解效果也呈現上升后下降的趨勢?？赡苡捎诿附鉁囟容^低，酶活性則較小，導致水解速度較慢，使酶解產物的DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量都較低；當反應溫度升高后，酶的活性會增強，同時蛋白質結構的展開，促使酶與底物進行充分反應，使水解速度加快，則酶解產物的DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量都有所上升；但當溫度進一步升高，伴隨著酶活性的逐漸失去，水解效果也逐漸變差，酶解釋放的活性多肽減少，從而使DPP-IV抑制率呈現下降趨勢。

圖3 溫度對DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白的影響

2.2.3 不同pH梯度對酶解產物DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量的影響

測定在不同pH條件下高粱醇溶蛋白水解產物的DPP-IV抑制效果和可溶性蛋白含量的變化，結果如圖4所示。當pH在5.0～5.5范圍變化時，隨著pH升高，水解產物的DPP-IV抑制率呈現上升趨勢，并在pH 5.5時達到最大值。當pH為5.5～6.5時，隨著pH的增大，DPP-IV抑制率逐漸變小?？赡苡捎趐H的改變對蛋白質的空間結構產生影響，導致酶解產生的有效肽段在類型和數量上有明顯差異，從而呈現出酶解產物的DPP-IV抑制率的差異變化?？扇苄缘鞍缀吭诖俗兓秶鷥葎t無顯著性變化，證明在此pH變化范圍內水解速度未發生明顯變化，這與木瓜蛋白酶的pH可適應范圍有一定的關系。

圖4 pH對酶解產物DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白的影響

2.2.4 蛋白酶添加量不同對酶解產物DPP-IV抑制活性及可溶性蛋白含量的影響

測定在不同的加酶量條件下高粱醇溶蛋白水解產物的DPP-IV抑制效果和可溶性蛋白含量的變化，結果如圖5所示。在蛋白酶添加量3 000～6 000 U/g范圍內，DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量隨著酶添加量的增加呈現上升趨勢，并且在6 000 U/g時達到最大值。當酶添加量超過6 000 U/g之后，在加酶量成倍增長的條件下，DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量均保持穩定的趨勢，沒有顯著性的差異變化。這與周建敏等[25]通過堿性蛋白酶制備高粱醇溶蛋白ACE抑制肽試驗中的結論類似。在蛋白酶添加量較少時，水解產物的DPP-IV抑制效果與加酶量呈正相關關系，當加酶量繼續增大時，DPP-IV抑制率逐漸趨于穩定。這是由于在酶添加量較少的情況下，伴隨酶量的增加，蛋白質逐漸分解完全，DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量也隨著逐漸增大，當蛋白酶的添加量達到6 000 U/g時，相對于底物而言，酶用量已趨向飽和，DPP-IV抑制率和可溶性蛋白含量達到峰值，繼續增加蛋白酶用量，并沒有多余的底物能與之結合，最終使DPPIV抑制率和可溶性蛋白含量的數值處于相對穩定。

圖5 酶添加量對酶解產物DPP-IV抑制活性和可溶性蛋白的影響

2.3 響應面優化酶解條件

2.3.1 中心組合試驗結果

Box-Behnken試驗設計的因素水平及結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計與結果

按照表2設計進行試驗，結果見表3。根據表3的結果，設定DPP-IV抑制率為響應值，使用Design-Expert.V 8.0.6軟件對響應值和各因素的編碼值進行回歸擬合分析，得到二次多元回歸方程：

Y=89.77+2.91A+3.82B-1.28C+6.02D-0.58AB+0.36AC-0.39AD+0.96BC+0.023BD+0.43CD-2.26A2-8.79B2-3.56C2-4.44D2

對回歸方程的方差分析結果見表4。從表4中可以看出，對DPP-IV抑制率所建立的回歸方程模型的顯著性（p＜0.000 1）極高，失擬項（p=0.077 9＞0.05）不顯著，模型的調整系數R2=0.940 1，表明該模型與實際試驗的擬合較好，自變量與響應面之間的線性關系較為顯著，試驗的誤差較小，因此，可以運用該回歸模型來分析和預測高粱醇溶蛋白制備DPP-IV抑制肽工藝效果。在回歸方程中，各因素的系數值是直接反映每個試驗因子與指標值的影響效果。由各因素的均方值可知，各因素對高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制率的影響順序為酶添加量＞溫度＞時間＞pH。從表4可以看出，方程中的一次項A、B、C、D與二次項A2、B2、C2、D2均是極顯著的；交互項均不顯著。綜上所述，響應值的變化十分復雜，各具體的試驗因素對DPP-IV抑制率的影響并非是簡單的線性關系，而是二次關系。分別將模型中的A（時間）、B（溫度）、C（pH）、D（酶添加量）因素其中的2個固定在0水平，可以得到另外2個因素的交互作用對DPPIV抑制率的子模型，通過觀察模型得到三維曲面圖，可以發現試驗的交互項均對抑制率無顯著影響。通過中心組合試驗所得的結果與二次多項回歸擬合方程，通過軟件Design-Expert.V 8.0.6得出獲得最高DPP-IV抑制率時各因素的最佳蛋白酶解條件：時間3.56 h、溫度50.97 ℃、pH 5.46、酶添加量7 947.45 U/g。在此條件下，高粱醇溶蛋白酶解產物的DPP-IV抑制率的理論值為92.96%。

表4 回歸模型的方差分析

2.3.2 響應面模型最佳條件的驗證

為了驗證響應面法的可行性，并考慮到操作過程中試驗的具體可實施性，在時間3.6 h、溫度51 ℃、pH 5.5、酶添加量8 000 U/g條件下進行驗證性試驗，通過重復3組平行試驗，得到的高粱醇溶蛋白的DPPIV抑制率平均值為91.97%，與預測值92.96%的誤差在1%以內，表明采用該響應面優化得到的酶解工藝參數模型可靠，對高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽的制備具有意義。

3 結論

應用響應面法優化木瓜蛋白水解酶水解高粱醇溶蛋白制備DPP-IV抑制肽的工藝參數，結果顯示，模型擬合度較高，可用于高效的高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽的制備預測與優化。酶解時間、酶解溫度、酶解pH、酶添加量均對DPP-IV抑制作用顯著。該工藝參數條件為時間3.56 h、溫度50.97 ℃、pH 5.46、酶添加量7 947.45 U/g。在此條件下，高粱醇溶蛋白的DPP-IV抑制率為91.97%，與預測值92.96%誤差為0.99%。研究為高粱醇溶蛋白DPP-IV抑制肽的高效制備和功能性研究提供了參考，為高粱醇溶蛋白進一步的研究奠定了基礎。