貝類內(nèi)源性消化酶的活性比較及其分離純化

王加祥 ，史亞萍 ，賈愛榮 ，張玉，劉昌衡 ，張綿松 *

1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省科學(xué)院生物研究所（濟(jì)南 250014）；2.山東省海珍品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室（濟(jì)南 250014）；3.中澳特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)合實(shí)驗室（濟(jì)南 250014）

海藻多糖占海藻干重的50%左右，成為非常有前景的一類海洋生物活性物質(zhì)。海藻多糖中的瓊脂、卡拉膠、褐藻酸鹽在工業(yè)上長期使用，但附加值普遍較低，如何實(shí)現(xiàn)海藻多糖的高值化利用成為發(fā)展趨勢。隨著海藻寡糖的生理作用不斷被揭示，海藻多糖降解酶應(yīng)用的重要趨向是著力于海藻寡糖的酶法生產(chǎn)，為新藥、新功能食品的開發(fā)提供手段。因此，海洋生物酶開發(fā)與應(yīng)用是海藻多糖高值化的關(guān)鍵。

貝類內(nèi)源酶由貝類消化系統(tǒng)分泌，有消化作用，能將海藻中的大分子多糖消化降解為可被生物體吸收的小分子營養(yǎng)成分，使其獲得維持生命、生長和繁殖等活動所需的能量和營養(yǎng)[1]。因此，貝類內(nèi)源酶具有水解海藻多糖的潛在能力。研究主要集中在幾大類的蛋白酶活性的研究，安賢惠等[2]比較5種貝類消化酶的蛋白酶、淀粉酶和酯酶的活性，不同來源的貝類消化酶有不同的比活力；文祝友[3]研究三角帆蚌消化系統(tǒng)中蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的酶活。張林林等[4]從海洋貝類腸道微生物中篩選到能夠降解瓊脂的海洋細(xì)菌，這也是一種從貝類獲得海藻多糖水解酶的一種方式，但是對貝類內(nèi)源性β-1, 3葡聚糖酶和昆布多糖酶的研究資料相對缺乏。

對黃海、渤海地區(qū)常見的四角蛤蜊、毛蚶、櫛孔扇貝、竹蟶、牡蠣、貽貝、縊蟶和菲律賓簾蛤共8種貝類的內(nèi)源性消化酶進(jìn)行提取，比較測定β-1, 3葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活性，并對分離得到的粗酶進(jìn)行分離純化，為昆布多糖改性、產(chǎn)物的抗輻射活性研究、功能性海藻多糖開發(fā)等方面應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

四角蛤蜊Mactra veneriformis（標(biāo)記為1）、毛蚶Scapharca subcrenata（標(biāo)記為2）、櫛孔扇貝Chlamys farreri（標(biāo)記為3）、竹蟶Solen strictus（標(biāo)記為4）、牡蠣ostrea gigas thunberg（標(biāo)記為5）、貽貝Mytilus edulis（標(biāo)記為6）、縊蟶Sinonovacula constricta（標(biāo)記為7）、菲律賓簾蛤Ruditapes philippinarum（標(biāo)記為8），均購自濟(jì)南海鮮大市場。

1.1.2 試驗試劑

Sephadex G25（Pharmacia）；昆布多糖（sigma）；Folin-酚蛋白定量試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；牛血清白蛋白、對硝基苯酚、對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（上海源葉生物科技有限公司）；其他試劑（均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器和設(shè)備

酶標(biāo)儀（Infinite M200 pro，TECAN公司）；凝膠成像儀（G：BOX-F3，Gene Company Limited）；自動部分收集器（BS-100A，上海滬西分析儀器廠有限公司）；電泳儀電源（DYY-12型，北京六一儀器廠）；垂直電泳槽（Mini PROTEAN 3 cell，美國Bio-Rad公司）；恒流泵（Millipore公司）；旋渦混合儀（XW-80A，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 粗酶的提取

將四角蛤蜊、毛蚶、櫛孔扇貝、竹蟶、牡蠣、貽貝、縊蟶和菲律賓簾蛤共8種鮮活貝類分別標(biāo)記為1～8，用金屬刀片撬殼，割斷閉殼肌，打開貝殼，取其消化腺，放入陶瓷研砵中稱其質(zhì)量，加入1∶3（g/mL）的4 ℃保溫的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（0.025 mol/L，pH 5.2），冰上研磨浸提30 min，在4 ℃，以10 000g離心20 min。用濾膜過濾上述離心后的粗酶提取液，用以除去大塊色素和其他大分子雜質(zhì)。

用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（0.025 mo l/L、pH 5.2）沖洗Sephadex G25凝膠柱，直至床面與液面齊平，關(guān)閉下出口。用一次性醫(yī)用塑料吸管將過濾后的上清液小心地加于凝膠上方脫脂棉，注意切勿攪動層析柱床表面，打開下端出口，待上清液基本完全進(jìn)入柱中后不斷補(bǔ)加緩沖液來洗脫并使緩沖液液面始終保持高于柱床一定高度。收集1個柱體積（約8 mL）收集液、1個柱體積之后的1 mL收集液以及第2個1 mL的收集液，分別記為a、b、c。即每種貝類對應(yīng)3個消化酶組分，以四角蛤蜊為例，消化酶組分依次為1a、1b、1c，其他樣品的標(biāo)注依次類推。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定

采用Lowry法[5]。

1.3.3β-1, 3葡聚糖酶酶活的測定[6-9]

取20 μL粗酶液，加入100 μL底物溶液（昆布多糖1 mg/mL）中，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃保溫1 h；采用Nelson法[10]測定反應(yīng)后溶液中的還原糖含量。用20 μL緩沖液代替粗酶液做空白對照組，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶解產(chǎn)物濃度。β-1, 3葡聚糖酶酶活的定義為：pH 5.2，37 ℃下每1 min水解昆布多糖產(chǎn)生1 μg葡萄糖為1個酶活力單位（U）；其比酶活的定義為：β-1, 3葡聚糖酶酶活單位數(shù)（U）與酶蛋白質(zhì)量（mg）之比。

1.3.4β-葡萄糖苷酶酶活測定[11-12]

取50 μL粗酶液，加入100 μL預(yù)先配好的底物溶液（對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，C12H15NO8，1 mg/mL）中，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃保溫20 min，同時做空白（50 μL緩沖液代替粗酶液）。20 min后取出各管，加入150 μL 1 mol/L Na2CO3溶液，確保蓋緊離心管蓋子，旋渦混合儀搖勻。每管取200 μL加入到該96孔板中，在410 nm波長下測定吸光度。根據(jù)對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計算對硝基苯酚的含量。β-1, 3葡聚糖酶酶活定義為：pH 5.2、37 ℃下每1 min水解4-硝基苯-β-D-半乳糖苷產(chǎn)生1 μg對硝基苯酚為1個酶活力單位（U）；其比酶活定義為：β-葡萄糖苷酶酶活單位數(shù)（U）與酶蛋白質(zhì)量（mg）之比。

1.3.5 離子交換柱層析法純化

采用DEAE-52纖維素裝柱，固定在4 ℃冰箱中，上樣緩沖液為含1 mol/L NaCl的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（0.025 mol/L、pH 5.2），采用梯度混合儀混勻，設(shè)定流速2 mL/min，每管收集2 mL，連續(xù)收集200管；采用Lowry法測定蛋白，根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)含量。

1.3.6 酶蛋白的相對分子質(zhì)量的測定

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行測定[13-14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 8種貝類的消化道酶酶活比較

不同貝類的消化酶中的β-1, 3葡聚糖酶酶活和β-葡萄糖苷酶酶活的比較見圖1。菲律賓簾蛤?qū)?yīng)的第2段純化組分（8b）的β-1, 3葡聚糖酶活性最高，比酶活為15.1 U/mg；貽貝對應(yīng)的第1段純化組分（6a）和縊蟶對應(yīng)的第2段純化組分（7b）的β-葡萄糖苷酶酶活最高，比酶活均為39.9 U/mg，不同貝類的消化道中酶的酶活不同的原因可能是其不同攝食能力，導(dǎo)致消化道的構(gòu)造差異顯著，所以不同貝類消化道酶活性不同。另外，吳寧等[15]研究發(fā)現(xiàn)對于一些貝類等，前腸的蛋白酶活性和淀粉酶活性最高，后腸最低，這說明消化道的不同部位的消化酶活性也存在差別。

圖1 8種貝類的消化道酶酶活比較結(jié)果

2.2 粗酶的純化

根據(jù)流速計算洗脫液實(shí)時濃度，根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線計算蛋白濃度，將結(jié)果繪制成折線圖，見圖2。

圖2 菲律賓簾蛤消化酶8b組分的梯度洗脫曲線

鹽濃度0.22和0.31 mol/L時，洗脫效果明顯，將22～24號管中的溶液進(jìn)行合并，31～33號管中的溶液進(jìn)行合并，并分別進(jìn)行濃縮和透析除鹽，測定蛋白質(zhì)含量和酶活，計算比酶活。結(jié)果表明，菲律賓簾蛤中β-1, 3葡聚糖酶的酶活力通過純化提高4.6倍，見表1。

表1 菲律賓簾蛤消化酶8b組分的純化倍數(shù)表

如圖3所示，洗脫效果不明顯，且各個組分的酶活性較低，因此分別適當(dāng)合并8～13號管，14～25號管，26～33號管中溶液，并分別進(jìn)行透析脫鹽和濃縮處理，分別測定蛋白質(zhì)含量和酶活，計算比酶活。

圖3 貽貝消化酶中6a組分的梯度洗脫曲線

結(jié)果表明，貽貝消化酶的6a（26～33）組分中β-1, 3葡聚糖酶的酶活力通過純化可以提高7.66倍，見表2。

表2 貽貝消化酶6a組分的純化倍數(shù)表

如圖4可知，鹽濃度為0.15，0.38和0.64 mol/L時，洗脫效果明顯；可將14～17號，36～41號，42～45號和64～68號管中溶液合并，并分別濃縮和脫鹽處理，分別測定蛋白質(zhì)含量和酶活，計算比酶活。結(jié)果表明，縊蟶消化酶的7b（36～41）組分中β-葡萄糖苷酶的純化倍數(shù)可以提高42.3倍，見表3。

表3 縊蟶消化酶7b組分的純化倍數(shù)表

圖4 縊蟶消化酶7b組分的梯度洗脫曲線

2.3 SDS-PAGE電泳分析

低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker（14.4～97.4 kDa）會在凝膠上形成6條條帶，分別為：相對分子質(zhì)量14.4 kDa的Lysozyme、相對分子質(zhì)量20.1 kDa的Growth Hormone、相對分子質(zhì)量31 kDa的Carbonic Anhydrase、相對分子質(zhì)量43 kDa的Actin、相對分子質(zhì)量66.2 kDa的BSA和相對分子質(zhì)量97.4 kDa的Phosphyorylase B，凝膠成像結(jié)果如圖5所示。

圖5 SDS-PAGE電泳分析

樣品A，即8b（22～24）組分，可見一條電泳條帶，相對分子質(zhì)量31～43 kDa，約35 kDa，與文獻(xiàn)報道的β-1, 3葡聚糖酶的分子質(zhì)量一致[9]。結(jié)合8b（22～24）組分洗脫曲線得，β-1, 3葡聚糖酶在NaCl濃度0.22 mol/L時被洗脫下來。樣品B，即6a（26～33）組分，可見5條電泳條帶，相對分子質(zhì)量分別在31～43 kDa（1條），43～66.2 kDa（2條）和66.2～97.4 kDa（2條），雜質(zhì)較多，無法分析。樣品C，即7b（64～68）組分的相對分子質(zhì)量約25 kDa。

3 結(jié)論

在試驗研究的8種海洋貝類中，貽貝和縊蟶來源的β-葡萄糖苷酶比活力和菲律賓簾蛤來源的β-1, 3葡聚糖酶比活力與其他貝類相比較高；利用Sephadex G25葡聚糖凝膠柱和DEAE-52纖維素柱可以有效提高β-1, 3葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活；分離純化得到的菲律賓簾蛤β-1, 3葡聚糖酶和縊蟶β-葡萄糖苷酶相對分子質(zhì)量分別為35和25 kDa，酶活分別為69.31和1 687.38 U/mg。該試驗為β-1, 3葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的特性和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。