青錢柳多酚提取工藝及抗氧化活性

張怡評 ，楊婷 ，洪專 ，盧紹基*，鄧明

1.自然資源部第三海洋研究所，海洋生物資源開發利用工程技術創新中心（廈門 361005）；2.廈門塔斯曼生物工程有限公司（廈門 361021）

青錢柳（Cyclocarya paliurus（Batal）Iljinskaja.）又名搖錢樹，系胡桃科青錢柳屬植物，多分布于熱帶和亞熱帶的山區，是中國特有的單種屬植物及國家重點保護的瀕危植物之一，主產于江西、湖南、貴州、廣西、湖北等地[1]。青錢柳的樹葉、樹皮、樹根都可以入藥，也可作為普通的食品原料，具有清熱解毒、生津止渴、止痛等功能[2]。研究發現，青錢柳葉含有多糖類、黃酮類、三萜及有機酸類化合物及一些無機元素等[3-7]，具有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化及調節機體免疫等多種生物活性[4-5,8-11]。關于青錢柳抗氧化活性研究主要集中在青錢柳多糖及黃酮類化合物上，體外抗氧化活性研究表明，青錢柳多糖及總黃酮能夠清除DPPH自由基、ABTS自由基及羥基自由基活性；大鼠體內抗氧化活性研究表明，青錢柳多糖能夠使高血脂大鼠肝臟的總超氧化物歧化酶的活性、谷胱甘肽過氧化物酶的活性、過氧化氫酶的活性及總抗氧化（T-AOC）顯著提高[12-15]。近年來，青錢柳葉作為食品、保健品的研究開發是其研究的重點，已有青錢柳保健茶等功能性食品上市[16]，然而，尚未見青錢柳多酚的提取及抗氧化活性的研究報道，試驗采用乙醇提取法提取青錢柳多酚化合物，對其抗氧化活性進行評價，為青錢柳功能性食品的開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

青錢柳（采自貴州省雷山縣，樣品留存廈門塔斯曼生物工程有限公司）；沒食子酸（純度98%，批號110831-201906，中國食品藥品檢定研究院）；福林酚試劑、碳酸鈉、無水乙醇、鄰苯三酚、Tris-HCl試劑、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）等（均為分析純，購自汕頭西隴化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

KQ5200E超生波提取器（昆山市超聲儀器有限公司）；UH5300紫外可見分光光度計（日立株式會社制作所）；DFT-200A萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；HH-ZK2水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；NT-901渦旋振蕩器（海門市其林貝儀器制造有限公司）；H1650-W離心機（湖南湘儀實驗儀器開發有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 青錢柳多酚提取單因素試驗

取青錢柳葉，粉碎，過0.180 mm粒徑篩，以乙醇體積分數（40%，50%，60%，70%和80%）、超聲提取時間（10，20，30，40，50和60 min）、超聲提取溫度（30，40，50，60和70 ℃）、料液比（1∶5，1∶15，1∶25，1∶35，1∶45和1∶55 g/mL）為單因素進行考察，篩選正交試驗因素及水平。

1.3.2 青錢柳多酚提取工藝優化

在單因素基礎上采用四因素三水平正交試驗設計進行優化。采用乙醇體積分數（60%，70%和80%）、超聲提取時間（10，20和30 min）、超聲提取溫度（40，50和60 ℃）、料液比（1∶25，1∶35和1∶45 g/mL）為單因素，正交試驗設計因素水平表見表1。

表1 正交試驗設計因素水平表

1.3.3 青錢柳多酚含量的測定

參照國標方法，采用福林酚測定法進行測定[17]。即以沒食子酸為標準品，配制成20 μg/mL標準沒食子酸溶液。分別吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL的沒食子酸標準溶液（20 μg/mL）置于10 mL離心管中，向試液中依次加入1.5 mL福林酚試劑和4 mL 8%碳酸鈉溶液，最后加水補齊到10 mL，渦旋混合后將離心管放置于30 ℃水浴中反應20 min，分別測定765 nm處溶液的吸光度。以沒食子酸濃度作為橫坐標，吸光度作為縱坐標繪制標準曲線。沒食子酸標準曲線見圖1，回歸方程為y=0.031x+0.043 3，R2=0.999，在4～20 μg/mL質量濃度范圍有良好的線性關系。吸取1 mL樣品液自加入福林酚試劑起按照步驟進行測定吸光度，用標準曲線計算多酚含量。

圖1 沒食子酸標準曲線

1.3.4 青錢柳多酚體外抗氧化活性研究

試驗參考文獻[18]方法，對青錢柳多酚的體外抗氧化活性進行評價，主要包括超氧陰離子自由基清除率測定、鐵離子還原力測定和DPPH自由基清除率測定。

1.3.4.1 超氧陰離子自由基清除率測定

鄰苯三酚的自氧化反應：取2 950 μL pH 8.2的0.05 mol/L Tris-HCl于石英比色皿中，加入50 μL 30 mmol/L的鄰苯三酚溶液，迅速混合，測定在波長325 nm的吸光度，每隔30 s測1次，300 s后停止，吸光度隨時間的變化即斜率為ΔA0。樣品溶液：取適量濃度的樣品XμL于石英比色皿中加入（2 950-X）μL pH 8.2的0.05 mol/L Tris-HCl，加入50 μL 30 mmol/L的鄰苯三酚溶液，迅速混合，測定在波長325 nm的吸光度，每隔30 s測1次，300 s后停止，吸光度隨時間的變化即斜率為ΔA樣，計算對超氧陰離子自由基清除率的影響。

1.3.4.2 鐵離子還原力測定

吸取1 mL一定濃度的多酚提取液于具塞試管中，加入2.5 mL pH 6.6的磷酸緩沖鹽和1 mL 1%的鐵氰化鉀，混勻，50 ℃恒溫水浴20 min后，取出急速冷卻（冰欲），加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混合后以3 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL雙蒸水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻靜置10 min，在700 nm波長下測定吸光度。

1.3.4.3 DPPH自由基清除率測定

取適量DPPH，用乙醇配制成質量濃度為0.04 mg/mL的溶液，避光儲存備用。取1.5 mL DPPH溶液，加適量提取液用乙醇補足到3 mL，靜置30 min，在517 nm波長下測定吸光度。將樣品配制成一定的濃度按照上述反應后測定，計算出對DPPH自由基清除率的影響。

式中：A0為未加提取液時DPPH溶液的吸光度；A1為加提取液時DPPH溶液的吸光度；A2為提取液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對青錢柳多酚提取率的影響

分別精密稱取5份青錢柳粉，各2.0 g，固定料液比1∶25（g/mL）、提取時間25 min，分別加入40%，50%，60%，70%和80%乙醇水溶液超聲提取，離心，上清液稀釋20倍后，按照1.3.3的方法進行測定并計算多酚提取率。

由圖2可見，隨著乙醇體積分數增加，青錢柳多酚的提取率先增加后下降，乙醇體積分數70%時，多酚的提取率最高，達到1.76%，采用80%乙醇提取，多酚提取率下降明顯。因此，乙醇體積分數選擇60%，70%和80%這3個水平進行正交試驗。

圖2 乙醇體積分數對青錢柳多酚提取率的影響

2.1.2 超聲提取時間對青錢柳多酚提取率的影響

分別精密稱取6份青錢柳粉，各2.0 g，固定料液比1∶25（g/mL），分別加入70%乙醇超聲，提取10，20，30，40，50和60 min，離心，上清液稀釋20倍后，按照1.3.3的方法進行測定。

由圖3可見，隨著超聲提取時間增加，多酚提取率逐漸升高，超聲提取時間從10 min到20 min提取率升高迅速，超聲提取20 min時的提取率為1.78%；超聲提取時間從20 min到50 min提取率升高趨勢趨于平緩，超聲提取時間50 min時，提取率為1.90%，延長30 min，提取率僅提高0.12%。因此超聲提取時間選擇10，20和20 min這3個水平進行正交試驗。

圖3 超聲提取時間對青錢柳多酚提取率的影響

2.1.3 超聲提取溫度對青錢柳多酚提取率的影響

分別精密稱取5份青錢柳粉，各2.0 g，固定料液比1∶25（g/mL），分別加入70%乙醇，于30，40，50，60和70 ℃超聲提取20 min，離心，上清液稀釋20倍后，按照1.3.3的方法進行測定。

由圖4可見，隨著提取溫度增加，青錢柳多酚的提取率先增加后下降，提取溫度達到50 ℃時，青錢柳多酚的提取率達到最高，為1.83%；提取溫度高于50℃時，多酚的提取率反而下降，可能是由于溫度過高導致多酚被破壞。因此，超聲提取溫度選擇40，50和60 ℃這3個水平進行正交試驗。

圖4 超聲提取溫度對青錢柳多酚提取率的影響

2.1.4 料液比對青錢柳多酚提取率的影響

分別精密稱取6份青錢柳粉，各2.0 g，采用不同料液比（1∶5，1∶15，1∶25，1∶35，1∶45和1∶55 g/mL），分別加入70%乙醇，于50 ℃超聲提取20 min，離心，上清液稀釋20倍后，按照1.3.3的方法進行測定。

由圖5可見，多酚提取率隨著料液比增加而升高，料液比增加到1∶35（g/mL）后，多酚的提取率增加趨于緩慢，因此料液比選擇1∶25，1∶35和1∶45（g/mL）這3個水平進行正交試驗。

圖5 料液比對青錢柳多酚提取率的影響

2.2 正交試驗結果

在青錢柳多酚提取單因素試驗結果基礎上，以青錢柳多酚提取率為評價指標，以乙醇體積分數（A）、超聲提取時間（B）、超聲提取溫度（C）和料液比（D）為4個提取因素，每個因素設定3個水平，采用四因素三水平正交試驗法進行提取工藝優化，按照1.3.3的方法進行測定，試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果

由表2青錢柳多酚提取正交試驗直觀分析結果可得，超聲提取時間對多酚提取率影響最顯著，料液比次之，乙醇體積分數對青錢柳多酚的提取率的影響最小。由表3方差分析結果可得提取時間對多酚提取率具有顯著性影響，試驗結果可得最佳提取工藝為A1B3C2D3，即以60%乙醇、料液比1∶45（g/mL），在50 ℃下超聲提取30 min為最佳提取工藝。

表3 正交試驗方差分析結果

2.3 工藝驗證試驗結果

精密稱取3份青錢柳粉，各2 g，按照確定的最佳提取工藝進行提取并測定，結果見表4。

表4 驗證試驗結果 單位：%

在選取的最佳提取工藝條件下，青錢柳多酚的平均提取率為1.87%，相對標準偏差為2.12%，所建立的最佳提取工藝穩定可行。

2.4 青錢柳多酚體外抗氧化活性試驗

2.4.1 青錢柳多酚的提取

取100 g青錢柳，根據正交試驗優化的最佳提取工藝進行提取多酚，過濾，濾液濃縮后冷凍干燥，開展體外抗氧化試驗研究。

2.4.2 超氧陰離子清除率測定結果

人體內存在一定數量的超氧陰離子，不發生化學變化對人體無害，但與羥基（OH-）結合后的產物會導致細胞DNA損壞，破壞人類機體功能，因此，適當攝入具有清除自由基活性的食物，對于保護人體機體功能具有重要意義[3,9]。由圖6可知，青錢柳多酚提取物對超氧陰離子的清除率呈劑量依賴性關系，相關系數為0.976，青錢柳多酚對超氧陰離子的IC50值為120.96 μg/mL。

圖6 青錢柳多酚對超氧陰離子的清除效果

2.4.3 鐵離子還原力測定結果

樣品的還原力與其抗氧化性具有明顯相關性，一般樣品的吸光度越大，樣品的還原力越強，其抗氧化活性越強[18]。測定青錢柳多酚對鐵離子還原力，試驗發現青錢柳多酚對鐵離子還原力隨著濃度增加而增強，青錢柳多酚對鐵離子還原力的IC50值為9.84 μg/mL，見圖7。

圖7 青錢柳多酚對鐵離子的還原力

2.4.4 DPPH自由基清除率測定結果

DPPH是一種有機自由基，被廣泛應用于定量檢測食品的抗氧化能力[18]。試驗考察青錢柳多酚對DPPH自由基的清除能力。結果發現，隨著青錢柳多酚質量濃度增加，其DPPH自由基清除能力增強，其質量濃度與清除率相關性為0.995，青錢柳多酚對DPPH自由基清除率的IC50為5.81 μg/mL，見圖8。

圖8 青錢柳多酚對DPPH自由基清除效果

3 結論

人體內正常的生理代謝過程也會產生含氧自由基，很多疾病和組織損壞都和體內的氧化應激反應有聯系，如果自由基過量就會加快細胞衰老，引起疾病[9]。前期有藥理研究發現青錢柳提取物（多糖或黃酮類物質）有清除自由基等抗氧化活性[9,13]，但尚未見青錢柳多酚提取的研究報道。采用單因素試驗結合正交試驗，建立青錢柳多酚的最佳提取工藝：以60%乙醇、料液比1∶45（g/mL），在50 ℃下超聲提取30 min，在此工藝下，青錢柳多酚的提取率可達1.96%。同時，對青錢柳多酚的體外抗氧化活性進行評價，結果表明，青錢柳多酚對DPPH自由基的清除率及鐵離子還原力較強，而對超氧陰離子自由基的清除率較弱，試驗結果可為青錢柳多酚在功能性食品等開發應用上提供參考。