牛奶蛋白肽抗氧化活性檢測

平秋婷

廣東省科學(xué)院生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所）（廣州 510316）

牛奶是一種比較常見的營養(yǎng)飲品，其味道香甜醇厚，富含蛋白質(zhì)、脂肪、糖以及多種維生素等營養(yǎng)成分，適用于不同年齡段的人群，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值[1]。開發(fā)和提取乳制品中的蛋白肽具有良好的發(fā)展前景和空間，引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注，其研究成果對乳制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有很大的促進(jìn)作用。利用蛋白酶水解牛奶蛋白肽質(zhì)提取到的活性多肽和復(fù)合氨基酸類物質(zhì)對人體有良好的營養(yǎng)功效，不僅可以提高消化吸收能力，還具有美顏、抗衰老功能[2]。尤其是牛奶的蛋白質(zhì)含量較高，其中不僅有豐富的氨基酸物質(zhì)，而且其占比相對比較適中，十分符合人體生理需要。因此，這類蛋白質(zhì)有較高的營養(yǎng)價(jià)值，可以優(yōu)先考慮作為人類食用的蛋白質(zhì)。

在對國內(nèi)外相關(guān)研究文獻(xiàn)進(jìn)行綜述的基礎(chǔ)上，探討通過酶解反應(yīng)從牛奶中提取氧化活性肽方法，并檢測牛奶蛋白肽抗氧化活性。研究有助于推動(dòng)天然產(chǎn)物酶解反應(yīng)理論發(fā)展，同時(shí)也為牛奶蛋白肽綜合利用提供新的技術(shù)指引。

1 材料及方法

1.1 原料與試劑

牛奶，市售；木瓜蛋白酶，丹麥Novo酶制劑公司；乙醚、乙醇、濃硫酸、氫氧化鉀、乙酸酐等，實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

SQP/Quintix224-1CN型電子天平（賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司）；UV2700島津紫外可見分光光度計(jì)（島津公司）；A11egra X-12臺(tái)式高速離心機(jī)（貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司）；Seven Compact，S210，pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；HWS-12數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市國旺儀器制造有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牛奶蛋白肽制備工藝

牛奶→加木瓜蛋白酶水解→滅酶→離心→烘干→蛋白肽

1.3.2 羥自由基（·OH）清除能力的測定

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定[3]。

1.3.3 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法[4]。

1.3.4 牛奶蛋白肽對豬油的抗氧化試驗(yàn)

NaS2O3-I2滴定法測定豬油試樣的脂肪過氧化值（POV）[5]。

1.3.5 羥自由基清除能力測定

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定[6]。

1.3.6 DPPH·清除率的測定

參照Butterfield的方法[7]。

1.3.7 還原力的測定

采用普魯士藍(lán)法[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛奶蛋白肽制備

由圖1可知，pH對酶解反應(yīng)具有決定性的影響。酶的催化效果受到pH顯著影響，隨著pH不斷上升，牛奶蛋白肽酶解反應(yīng)水解度也會(huì)相應(yīng)增加，水解效果不斷提升；當(dāng)pH達(dá)到理想水平后，此時(shí)pH如果繼續(xù)增大，則水解度開始降低。因此牛奶蛋白肽制備的pH為7較為合適。

圖1 pH對牛奶蛋白肽制備的影響

由圖2可知，在不同溫度環(huán)境下，牛奶蛋白肽水解反應(yīng)效果也有明顯差異，當(dāng)溫度逐漸上升時(shí)，水解度逐漸上升；當(dāng)溫度達(dá)到一定程度后，水解度開始下降。這是因?yàn)椋?dāng)溫度上升時(shí)，酶分子與底物分子活性不斷上升，底物與酶分子加速結(jié)合，這有利于加快酶反應(yīng)速度，但是如果溫度達(dá)到較高值后，蛋白酶活性會(huì)顯著下降。因此，牛奶蛋白肽制備的適宜溫度是40 ℃。

圖2 溫度對牛奶蛋白肽制備的影響

由圖3可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度不斷上升時(shí)，反應(yīng)水解度隨之上升；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度達(dá)到30 g/L時(shí)，酶催化反應(yīng)達(dá)到峰值，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度繼續(xù)上升，反應(yīng)水解度隨之開始下降。這是因?yàn)椋?dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度繼續(xù)上升，蛋白出現(xiàn)部分剩余，導(dǎo)致二者接觸不充分，從而限制了酶對蛋白的水解促進(jìn)效果。因此，牛奶蛋白肽制備的底物質(zhì)量濃度設(shè)置在30 g/L水平比較合理。

圖3 底物質(zhì)量濃度對牛奶蛋白肽制備的影響

由圖4可知，當(dāng)加酶量不斷上升，水解效果也在不斷提升；當(dāng)加酶量上升到70 000 U/g后，水解度效果不再改善，而是保持水平狀況，這意味著加酶量達(dá)到飽和，即使再增加也不會(huì)影響水解度。考慮到經(jīng)濟(jì)效益，加酶量定為70 000 U/g比較適宜。

圖4 加酶量對牛奶蛋白肽制備的影響

由表1和表2可以看出，牛奶蛋白肽制備條件中，pH、溫度、底物質(zhì)量濃度、加酶量對結(jié)果影響顯著。提取率二次回歸擬合方程：水解度=+9.42+0.77A-0.36B+0.95C+0.5D+0.29AB-0.15AC-0.53AD-0.12BC+0.87BD-0.45CD-1.06A2-0.25B2-0.76C2-0.57D2（其中，A是pH，B是溫度、C是底物質(zhì)量濃度，D是加酶量）。

表1 牛奶蛋白肽制備的工藝因素和水平

表2 牛奶蛋白肽制備試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，pH、溫度、底物質(zhì)量濃度、加酶量、牛奶蛋白肽制備響應(yīng)面模型p＜0.000 1，極顯著。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

由圖5可知，牛奶蛋白肽制備試驗(yàn)失擬項(xiàng)不顯著，F(xiàn)=1 078.207，p＜0.000 1，模型極顯著，所以能對牛奶蛋白肽制備的條件進(jìn)行預(yù)測。得到牛奶蛋白肽制備的最佳條件為pH 7.4、溫度35.7 ℃、底物質(zhì)量濃度31.3 g/L、加酶量72 771 U/g。

圖5 各因素響應(yīng)面圖

2.2 DPPH·清除能力的測定

由圖6可知，當(dāng)質(zhì)量濃度上升時(shí)，牛奶蛋白肽和VC清除DPPH·的效果也會(huì)不斷改善，當(dāng)質(zhì)量濃度上升到4 mg/mL時(shí)，牛奶蛋白肽對DPPH·的清除率達(dá)到84.5%，VC的清除率達(dá)到75.7%。牛奶蛋白肽清除清除DPPH·的效果要比VC更好。

圖6 牛奶蛋白肽對DPPH·的清除能力

2.3 ·OH清除能力的測定

由圖7可知，當(dāng)質(zhì)量濃度不斷上升時(shí)，牛奶蛋白肽、VC對·OH清除效果也在不斷改善，牛奶蛋白肽質(zhì)量濃度低于2 mg/mL時(shí)的清除效果差于VC；當(dāng)牛奶蛋白肽質(zhì)量濃度超過2 mg/mL時(shí)，其清除效果顯著改善，清除效果要好于VC。當(dāng)牛奶蛋白肽質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/mL，其對·OH的清除率為89.3%。牛奶蛋白肽對·OH有明顯清除效果。

圖7 牛奶蛋白肽對·OH的清除能力

2.4 O2-·清除能力的測定

由圖8可知，在一定質(zhì)量濃度下，牛奶蛋白肽、VC都具有清除O2-·的能力。當(dāng)牛奶蛋白肽質(zhì)量濃度不斷上升，牛奶蛋白肽、VC對O2-·清除效果也會(huì)相應(yīng)提高。在較低質(zhì)量濃度水平上，牛奶蛋白肽對O2-·的清除效果要差于VC，當(dāng)牛奶蛋白肽質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，其清除效果好于VC，而且效果更加顯著。

圖8 牛奶蛋白肽對O2-·的清除能力

2.5 還原力測定

從圖9中可以看出，當(dāng)牛奶蛋白肽質(zhì)量濃度不斷上升時(shí)，吸光度相應(yīng)增強(qiáng)，這時(shí)還原力也會(huì)開始上升。從這可以看出，當(dāng)牛奶蛋白肽質(zhì)量濃度超過3 mg/mL后，牛奶蛋白肽的吸光度值大于VC，這意味著牛奶蛋白肽有更好的還原能力。

圖9 牛奶蛋白肽還原力測定

2.6 對豬油的抗氧化測定

由圖10可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間不斷增加時(shí)，豬油的脂肪過氧化值（POV）呈現(xiàn)明顯分化。從圖中可以看出，對照組脂肪過氧程度最顯著，而牛奶蛋白肽組的POV值變化不顯著。反應(yīng)時(shí)間持續(xù)120 h后，對照組的POV值為牛奶蛋白肽組的3.3倍。因此，牛奶蛋白肽能夠顯著提升豬油的抗氧化效果。

圖10 豬油POV值與時(shí)間變化的關(guān)系

3 結(jié)論

牛奶蛋白肽制備工藝：pH為7.4、溫度為35.7 ℃、底物質(zhì)量濃度為31.3 g/L、加酶量為72 771 U/g。同時(shí)，牛奶蛋白肽對DPPH·、·OH和O2-·具有較強(qiáng)清除能力，有較強(qiáng)的還原能力，對豬油有較好的抗氧化能力。