二氫槲皮素對添加甘油解豬油肉餅抗氧化

李楊，唐志國，劉麗美，馬麗媛，劉東琦

綏化學院食品與制藥工程學院（綏化 152061）

甘油解豬油是以豬油和甘油為原料在無水環(huán)境下進行甘油解反應(yīng)得到，是甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯和游離脂肪酸的混合物，其中甘油二酯含量相對較高[1]。近些年研究表明甘油二酯擁有營養(yǎng)價值高、人體食用后安全、易于加工等特點，還擁有抑制體重增加、降血脂、減少內(nèi)臟脂肪積累等功效，是適合人類食用的保健性油脂[2-3]，然而豬油甘油二酯的氧化穩(wěn)定性相對較弱[4]，限制了其在肉制品中的應(yīng)用。

二氫槲皮素是一類重要的二氫黃酮類化合物，廣泛存在于落葉松中[5]。由于二氫槲皮素為多羥基化合物，特別是5—OH、7—OH及3’、4’臨位二羥基的存在，使其具有較強的抗氧化能力[6]。同時，二氫槲皮素還具有抗腫瘤、抗輻射、抗病毒、抑菌等作用，還可以改善心腦血管疾病[7-9]。二氫槲皮素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強效純天然抗氧化劑[10]。二氫槲皮素有較好的水溶性，極易溶于熱水，在冷水中也比大多數(shù)黃酮類物質(zhì)更易溶解，但其在油相中的溶解性較差，限制了其在油脂體系的應(yīng)用和發(fā)展。

本研究將二氫槲皮素通過反相微乳法包裹進甘油解豬油中，并將其應(yīng)用于肉糜體系，不僅可以提高二氫槲皮素的穩(wěn)定性和生物利用度，而且可以獲得具有甘油解豬油和二氫槲皮素雙重功能特性的肉制品，同時解決含甘油解豬油的肉糜制品在貯藏期間出現(xiàn)的氧化問題，該研究為功能性肉制品的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬背最長肌（綏化市大潤發(fā)超市）；豬背脂肪（黑龍江北大荒肉業(yè)有限公司）；二氫槲皮素（西安拓豐生物有限公司）；2, 4-二硝基苯肼（DNPH）、5, 5’二硫代二硝基苯甲酸鹽（DNTB）（美國Sigma公司）；硫代巴比妥酸TBA（上海山浦化工有限公司）；鹽酸胍（上海源葉生物科技有限公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

JJ-2B型組織搗碎機（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；UT-1800型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；FW12型絞肉機（廣東韶關(guān)食品機械廠）；XK96-B型漩渦振蕩器（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）；GL-21M型高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 甘油解豬油的制備

參照Diao等[4]的方法采用酶法甘油解制備甘油解豬油，使用高效液相色譜分析甘油二酯含量。

1.2.2 微乳液的制備

將1.2.1得到的甘油解豬油與吐溫-80以質(zhì)量比1∶1混勻后，再與丙三醇以質(zhì)量比為6∶4的比例于燒杯內(nèi)再次混合均勻，逐滴加入一定濃度的二氫槲皮素溶液，用磁力攪拌器進行攪拌同時溫度調(diào)至60 ℃，當體系變渾濁時即得富含二氫槲皮素的甘油解豬油微乳液。

1.2.3 肉餅的制作

將新鮮豬里脊肉去除筋膜和多余脂肪，切成小塊、用絞肉機絞碎成泥，隨機分成4組（每組900 g）進行如下處理：T1組為900 g肉+100 g脂肪；T2組為900 g肉+92 g甘油解豬油+25 g微乳液；T3組為900 g肉+84 g甘油解豬油+50 g微乳液；T4為900 g肉+100 g甘油解豬油。每個處理組的瘦肉與脂肪質(zhì)量比為均9∶1，T2組和T3組中二氫槲皮素含量分別為0.1和0.2 g/kg，每組中均加入2%的食鹽，斬拌混合均勻后，取50 g肉糜，制成直徑約8 cm，厚度約1 cm的肉餅，參照Jia等[11]的方法，將肉餅放入保鮮盒中，用保鮮膜封好，置于4 ℃冰箱貯藏8 d，每隔2 d取樣放入勻漿機中粉碎3次，每次10 s，測定各指標。

1.2.4 肌原纖維蛋白的提取

參照Xia等[12]的方法從不同處理組的肉糜中提取，以牛血清蛋白為標準品，利用雙縮脲法測定蛋白濃度。

1.2.5 過氧化值（peroxide value，POV）的測定

根據(jù)GB/T 5009.37—2003中滴定法測過氧化值的方法，分別稱取處理組絞碎的肉餅各2 g，加入30 mL氯仿和冰乙酸（體積比為2∶3）溶解樣品，加入1 mL飽和碘化鉀溶液搖勻后置于暗處3 min，取出加入100 mL蒸餾水，用0.002 moL/L Na2S2O3標準溶液滴定，至淡黃色時，加入1 mL淀粉指示劑搖勻后繼續(xù)滴定至藍色消失，記錄消耗Na2S2O3的體積，不加肉樣按相同方法作空白試驗，結(jié)果以meq/kg肉樣表示。

1.2.6 共軛二烯烴含量的測定

參考Lee等[13]的試驗稍加改動，稱量絞碎后的肉樣0.5 g，加入5 mL蒸餾水勻漿，然后取勻漿液0.5 mL與5 mL提取液（正己烷：異丙醇，體積比3∶1），振蕩1 min混勻后離心（2 000g，5 min），取上清液在233 nm處測吸光度，使用25 000（mol·cm）-1作為摩爾吸光系數(shù)，結(jié)果用μmol/mg肉樣表示。

1.2.7 硫代巴比妥酸值（TBARS）的測定

根據(jù)Tarladgis等[14]的方法進行，取絞碎肉樣2.5 g，加入17.5 mL 7.5%三氯乙酸（含0.1%乙二胺四乙酸）在高速勻漿機中勻漿后離心（3 000g，2 min）。取5 mL上清液和5 mL 0.02 mol/L的硫代巴比妥酸（TBA）溶液混勻后水浴煮沸40 min，冷卻至室溫，532 nm處測吸光度，TBARS值以每kg肉樣中所含丙二醛的毫克數(shù)表示。

1.2.8 酸價的測定

稱取絞碎肉樣3 g，加入50 mL乙醚-乙醇（體積比2∶1）混合液，漩渦振蕩，滴入酚酞指示劑2～3滴，用0.05 mol/L KOH溶液滴定，至出現(xiàn)微紅色，且0.5 min內(nèi)不褪色，即達到滴定終點。結(jié)果以每g肉樣消耗KOH的毫克數(shù)表示。

1.2.9 羰基含量的測定

參照Oliver等[15]的方法稍有改動。將蛋白質(zhì)濃度調(diào)整為5 mg/mL，取1 mL蛋白溶液加入1 mL二硝基苯肼溶液（10 mmol/L），室溫靜置1 h，期間每15 min漩渦振蕩1次，隨后加入20%的三氯乙酸（1 mL），8 500g離心10 min，沉淀用1 mL乙酸乙酯-乙醇（體積比1∶1）混合試劑洗3次，除去沒有參加反應(yīng)的試劑，再加入3 mL鹽酸胍溶液（6 mol/L），37 ℃保溫15 min，充分溶解沉淀后8 500g再離心3 min，除去不溶的物質(zhì)，370 nm處測上清液吸光度。對照組在開始時加入1 mL不含二硝基苯肼的HCl（2 mol/L），其余操作與上述步驟相同。羰基含量使用分子吸光系數(shù)22 000 L·mol/cm來計算，結(jié)果表示為nmol羰基/mg蛋白。

1.2.10 巰基含量的測定

參考Ellman[16]的方法略加改動，使用5, 5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽（DTNB）進行測定。將蛋白質(zhì)濃度調(diào)整為5 mg/mL，取1 mL蛋白溶液加入8 mL Tris-甘氨酸緩沖液（pH 8.0）混合均勻。取4.5 mL混合液加入0.5 mL含10 mmol/L DTNB的Ellman試劑，混勻后室溫避光反應(yīng)30 min，隨后冷凍離心15 min（10 000g，4 ℃），上清液于412 nm下測定吸光度，以未加入DNTB為對照。巰基含量使用分子吸光系數(shù)13 600（mol·cm）-1來計算，結(jié)果表示為nmol巰基/mg蛋白。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗重復(fù)三次，結(jié)果均用平均數(shù)±SD表示。差異顯著性（p＜0.05）分析采用Statistix 8.1軟件進行，作圖采用Sigmaplot 12.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氫槲皮素微乳液對過氧化值的影響

過氧化值（POV）可以反映氫過氧化物含量，代表脂質(zhì)初級氧化的程度[17]。圖1看出，各處理組肉餅的過氧化值隨著貯藏時間的延長均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，貯藏第6天，只添加甘油解豬油的豬肉餅（T4組）POV值顯著高于其他處理組（p＜0.05），這可能是由于甘油解豬油中含有的甘油二酯，其氧化穩(wěn)定性較低[4]，而添加了二氫槲皮素甘油解豬油微乳液的豬肉餅（T2組和T3組）POV值相對較低，且T3組的POV值低于T2組，這是因為T3組中雖然含有較高的甘油解豬油，但二氫槲皮素含量也高，劉妍等[10]報道，二氫槲皮素可有效抑制油脂的氧化。貯藏第6天后，所有處理組的POV值均下降，說明經(jīng)過誘導(dǎo)期后，氫過氧化物的降解速率高于其生成速率[18]。Georgantelis等[19]報道富含迭迭香提取物的豬肉腸在貯藏過程中，POV值也出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。

圖1 二氫槲皮素微乳液對冷藏豬肉餅POV的影響

2.2 二氫槲皮素微乳液對共扼二烯含量的影響

肉開始氧化時，不飽和脂肪酸雙鍵會發(fā)生位移，形成共軛體系，可以用分光光度法測定[17]。圖2看出，添加了二氫槲皮素甘油解豬油微乳液的豬肉餅在貯藏期間，共軛二烯烴的濃度顯著低于添加甘油解豬油和豬脂肪的肉餅（p＜0.05），說明二氫槲皮素有效抑制了脂質(zhì)氧化。共軛二烯烴的形成與氫過氧化物有關(guān)，也是發(fā)生在脂質(zhì)氧化的初期階段，隨著貯藏時間的延長，脂質(zhì)氧化中間產(chǎn)物開始降解而引起含量降低，共軛二烯烴的形成在貯藏第4天時，所有處理組均達到最高值，隨后迅速降低。Pena-Ramos等[20]在乳清和大豆分離蛋白水解物對熟肉糜脂質(zhì)氧化抑制的研究中也發(fā)現(xiàn)，貯藏前期共軛二烯烴濃度迅速升高，隨后降低。

圖2 二氫槲皮素微乳液對冷藏豬肉餅共軛二烯烴的影響

2.3 二氫槲皮素微乳液對TBARS值的影響

脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）能與硫代巴比妥酸反應(yīng)生成有色化合物，進而可以衡量脂質(zhì)二次氧化程度。圖3所示，在貯藏過程中，各處理組的TBARS值均呈現(xiàn)整體上升趨勢，貯藏到第8天，各處理組的TBARS值急劇升高，這可能是由于隨著脂肪氧化程度的加深，初期氧化產(chǎn)物進一步分解生成醛、酮等次級氧化產(chǎn)物所致。添加了二氫槲皮素甘油解微乳液的處理組（T2和T3）在整個貯藏過程中顯著低于添加甘油解豬油的T4組，這可能是因為二氫槲皮素結(jié)構(gòu)的特殊性，決定了其具有較強的抗氧化性[21]。

圖3 二氫槲皮素微乳液對冷藏豬肉餅TBARS值的影響

2.4 二氫槲皮素微乳液對酸價的影響

油脂貯藏過程中，在微生物、酶和熱的作用下會發(fā)生水解，產(chǎn)生游離脂肪酸，氧化程度越高，酸價越高，產(chǎn)品酸敗越嚴重，因此酸價也是用來評價油脂氧化變質(zhì)程度的一個重要指標。圖4所示，隨著貯藏時間的延長，酸價呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，添加甘油解豬油和豬脂肪的肉餅（T4和T1）酸價顯著高于添加二氫槲皮素甘油解豬油的肉餅（T2和T3）（p＜0.05），說明二氫槲皮素能顯著抑制脂質(zhì)的氧化，且含量越高，效果越好，但T4組和T1組差異并不顯著（p＞0.05）。周生學等[22]對長白落葉松3種黃酮化合物的抗氧化活性進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二氫槲皮素表現(xiàn)出較強的抗氧化活性。

圖4 二氫槲皮素微乳液對冷藏豬肉餅酸價的影響

2.5 二氫槲皮素微乳液對羰基含量的影響

蛋白質(zhì)氨基酸殘基受到自由基攻擊，會被氧化，進而生成羰基化合物，因此羰基含量可以作為蛋白質(zhì)氧化的一個重要指標[23]。圖5看出，隨著貯藏時間的延長，各處理組的羰基含量均呈現(xiàn)出不斷增加的趨勢，且添加甘油解豬油和豬脂肪的肉餅（T4和T1）顯著高于添加二氫槲皮素甘油解豬油的肉餅（T2和T3）（p＜0.05），說明T4和T1組氨基酸的側(cè)鏈更易被活性氧攻擊，生成較多的NH3和羰基衍生物[24]，而添加二氫槲皮素甘油解豬油的T2和T3組被氧化程度較低，且添加較多二氫槲皮素的T3組蛋白被氧化程度最低。這可能是由于二氫槲皮素具有清除自由基的能力。

圖5 二氫槲皮素微乳液對冷藏豬肉餅羰基含量的影響

2.6 二氫槲皮素微乳液對巰基含量的影響

蛋白質(zhì)氧化的另一個重要指標是巰基含量，蛋白分子被自由基攻擊后，空間構(gòu)象發(fā)生變化，內(nèi)部的巰基暴露，被氧化生成二硫鍵，巰基含量下降的越多，說明蛋白質(zhì)氧化的程度越高[25]。圖6看出，各處理組巰基含量隨著貯藏時間的延長，均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，添加二氫槲皮素甘油解豬油的肉餅（T2和T3）下降的幅度相對添加甘油解豬油和豬脂肪的肉餅（T4和T1）比較緩慢，說明二氫槲皮素的分子結(jié)構(gòu)能夠抑制自由基的產(chǎn)生[26]。有研究表明[25]，脂肪氧化生成的氫過氧化物和醛類等物質(zhì)會誘發(fā)蛋白質(zhì)的氧化，反過來蛋白質(zhì)氧化釋放的金屬離子又會加速脂肪的氧化。因此本研究得出二氫槲皮素能夠抑制蛋白氧化與抑制脂肪的氧化結(jié)果相一致。

圖6 二氫槲皮素微乳液對冷藏豬肉餅巰基含量的影響

3 結(jié)論

隨著貯藏時間的延長，添加甘油解豬油和豬脂肪的肉餅脂肪和蛋白質(zhì)的氧化程度不斷加深，表現(xiàn)為TBARS值、酸價和羰基含量不斷上升，巰基含量不斷下降，POV值和共軛二烯烴先上升后下降；而添加富含二氫槲皮素甘油解豬油后能顯著抑制脂肪和蛋白的氧化，有效減緩氧化進程，因此甘油解豬油能很好地保護二氫槲皮素的抗氧化活性，使其均勻地分布于肉制品中，賦予肉制品雙重功效。然而關(guān)于二氫槲皮素微乳液對肉餅品質(zhì)的影響有待進一步研究。