蒲公英黃酮對酪氨酸酶的抑制機理

吳穎，王佳其，唐文，井玉林，劉晴，王露

1.上海應用技術大學化學與環境工程學院（上海 201418）；2.上海應用技術大學香料香精技術與工程學院（上海 201418）

黃酮類化合物是多以游離態或糖苷類等形式存在于植物體內，含有2-苯基色原酮（flavone）結構的一類天然產物，其主要包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮類、花色素類等物質[1]，具有抑菌消炎、抗氧化及美白等多種功效[2]。黃酮類物質的美白作用機理可能是通過多種途徑進行的，如黃酮化合物可作為酪氨酸酶的底物類似物與酶的活性位點結合，競爭性抑制酪氨酸酶活性，影響黑色素的形成[3]；部分黃酮類化合物通過具有還原性和親水性的酚羥基結合酪氨酸酶分子上的二價銅離子抑制酶活。此外，黃酮化合物兩個苯環上的酚羥基很容易被氧化成醌類物質，從而清除氧自由基延緩衰老。付小華[4]研究表明甘草黃酮對酪氨酸酶具有較強的抑制作用，與日化行業中常用的美白劑，如維生素C衍生物、熊果苷、曲酸等相比，甘草黃酮天然安全、毒性更低。付建紅等[5]通過酪氨酸酶抑制動力學研究發現，桑葉黃酮對酪氨酸酶的抑制作用是可逆的混合型抑制。由于黃酮類化合物具有美白抗氧化、抑菌等多種功效，且來源天然安全、毒副作用小，進而成為天然美白化妝品原料的研究熱點。

蒲公英是一種常見的傳統藥食兩用草本植物，在我國很多地區均可生長，且價格低廉。文獻報道蒲公英具有抗炎抑菌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、清熱解毒等多種功能[6-7]。蒲公英醇提物中含有20余種黃酮類化合物，其中槲皮素、木犀草素、芹菜素、蘆丁等物質含量較高[8]。槲皮素和蘆丁對酪氨酸酶均有很強的抑制作用，研究發現槲皮素和蘆丁對酪氨酸酶的半抑制濃度分別為49.12和90.00 μmol/L[9-10]。關于蒲公英黃酮的提取、抗氧化、抗菌抗炎等方面的報道較多，但關于蒲公英黃酮在抑制酪氨酸酶活性及其抑制機理方面的研究鮮有報道，該文通過優化條件提取蒲公英黃酮，并研究其對酪氨酸酶活性的作用及其抑制機理等，以期開發蒲公英黃酮類物質在美白等日化產品中應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英（上海人和堂國藥總店）；酪氨酸酶（美國Sigma公司）；L-多巴、熊果苷（上海泰坦科技股份有限公司）；DPPH、蘆丁標準品、維生素C（上海寶曼生物科技有限公司）；無水乙醇、氫氧化鈉、碳酸鈉、硝酸鋁等試劑（均為國產分析純）。

1.2 儀器與設備

722S型可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；RE-5299旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；JP-300B-6D型粉碎機（永康市久品工貿有限公司）；TDZ4A-WS型離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司）。

1.3 蒲公英黃酮的制備

以料液比、乙醇濃度、提取時間為單因素，優化提取蒲公英黃酮的過程為：稱取蒲公英粉末約2 g，按不同料液比（1∶125，1∶100，1∶75和1∶50（g/mL）），加入一定量的乙醇水溶液，乙醇體積分數分別為55%，60%，65%，70%，75%和80%，加熱回流，提取時間分別為90，120，150和180 min，抽濾，濾液經旋轉濃縮后得蒲公英黃酮。優化后的最佳提取條件：乙醇體積分數為70%、料液比為1∶75（g/mL）、加熱回流時間為2 h。

1.4 黃酮標準曲線的繪制

參考文獻采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法[11]繪制黃酮標準曲線，稱取蘆丁標準品10.0 mg，以體積分數30%的乙醇水溶液溶解配制質量濃度0.2 mg/mL的蘆丁標準液。取不同體積的蘆丁標準液，補加30%乙醇至5 mL，再分別加入0.3 mL質量分數為5%亞硝酸鈉溶液和0.3 mL質量分數為10%硝酸鋁溶液，混勻靜置6 min后加入4 mL質量分數4%的氫氧化鈉溶液，用30%乙醇補至總體積為10 mL，靜置15 min，在505 nm波長下測量體系的吸光度值。空白參比對照為30%乙醇。以吸光度（A）為縱坐標，蘆丁的質量濃度（C）為橫坐標作圖，得到標準曲線方程：A=7.25C+0.028 2，R2=0.999。

1.5 酪氨酸酶抑制率的測定

具體操作根據參考文獻[12-13]所提供的方法。取1.5 mL pH為6.8的磷酸緩沖液和0.5 mL活度50 U/mL的酪氨酸酶溶液，加入1 mL不同質量濃度的蒲公英黃酮，混勻靜置10 min后加1 mL 0.01 mol/L的L-多巴溶液，靜置10 min后在475 nm波長處測量體系的吸光度值。以磷酸緩沖溶液為空白對照，熊果苷作為陽性對照，抑制率計算如式（1）。

式中：ODA為有酪氨酸酶但不含蒲公英黃酮組吸光度；ODB為不含酪氨酸酶和蒲公英黃酮組吸光度；ODC為含有酪氨酸酶和蒲公英黃酮組吸光度；ODD為有蒲公英黃酮但不含酪氨酸酶組吸光度。

1.6 酪氨酸酶抑制機理及動力學研究

根據李倩等[14]的方法，以0.01 mol/L的L-多巴為底物，保持其加入量1 mL，加入不同質量濃度（0，0.1，0.4，0.8，1.0和1.2 mg/mL）的蒲公英黃酮溶液，酶添加量分別為0.5，0.7，1.0和1.2 mL，按照1.5中的操作步驟，測定每個質量濃度的蒲公英黃酮溶液在不同體積酪氨酸酶下對酪氨酸酶催化氧化L-多巴能力的影響。

保持酪氨酸酶的添加量1 mL，改變底物L-多巴的濃度（1，2，4，6，8和10 mmol/L），測定不同質量濃度（0，3，4和5 mg/mL）蒲公英提取物對酪氨酸酶活力的影響，以底物L-多巴濃度的倒數（S-1）對酶反應速率的倒數（V-1）作圖，繪制Lineweaver-Burk雙倒數曲線，根據米氏方程來判斷蒲公英黃酮對酪氨酸酶的抑制作用類型以及相關動力學參數[15]。

1.7 抗氧化活性測定

參考Nasab等[16]的方法，將不同質量濃度的蒲公英黃酮溶液與0.16 mmol/L DPPH的乙醇溶液相混合，避光放置40 min，在517 nm波長處測定吸光度值（無水乙醇為空白對照）。

2 結果與分析

2.1 蒲公英黃酮對酪氨酸酶活力的抑制率

以最佳提取條件所得蒲公英黃酮的提取率最高為3.47%。楊嵐等[17]對蒲公英花醇提取液中總黃酮含量進行測定，其總黃酮含量為3.65%，實驗提取物總黃酮含量與之相當，但高于張智等[18]通過復合酶法提取蒲公英總黃酮含量為1.509%。進一步研究蒲公英黃酮對酪氨酸酶酶活的抑制作用，并以熊果苷為陽性對照，結果如圖1所示。隨蒲公英黃酮和熊果苷質量濃度增大，其對酪氨酸酶活性的抑制作用也增強，蒲公英黃酮對酪氨酸酶的半抑制質量濃度（IC50）約2.5 mg/mL，略優于熊果苷對酪氨酸酶的半抑制質量濃度（IC50）2.97 mg/mL。文獻報道甘草提取物對酪氨酸酶的半抑制質量濃度（IC50）為2.94 mg/mL[19]，甘草提取物是目前美白日化產品中常用的天然美白劑，蒲公英黃酮的美白作用與其相當，且蒲公英作為傳統藥食兩用植物，效優價廉，安全性極高，因而可作為一種具有良好研發價值的天然酪氨酸酶抑制劑。

圖1 蒲公英黃酮對酪氨酸酶的抑制作用

2.2 蒲公英黃酮對酪氨酸酶活性的抑制效應

以一定濃度的L-多巴為底物，添加不同量的酪氨酸酶，考察不同質量濃度的蒲公英黃酮對酪氨酸酶酶活的影響，結果如圖2所示。酶活力隨酶體積增加逐漸增大，在相同酶量的條件下，隨著蒲公英黃酮質量濃度的增大，酶活力逐漸下降。酶活力對酶體積作圖得到一組過原點的直線，且隨著蒲公英黃酮質量濃度的增大，直線的斜率逐漸減小，說明黃酮提取物對酪氨酸酶活性的抑制屬于可逆抑制[20]。也就是說蒲公英黃酮通過抑制酪氨酸酶活力實現降低其催化氧化L-多巴的能力，而不是通過減少有效酪氨酸酶的數量或直接使酶失去活力。

圖2 蒲公英黃酮對酪氨酸酶活力的抑制機理

2.3 蒲公英黃酮對酪氨酸酶的抑制動力學

以底物L-多巴濃度的倒數為橫坐標，酪氨酸酶活力反應初速度的倒數為縱坐標，縱截距代表1/Vm（酶促最大反應速率），通過Lineweaver-Burk雙倒數作圖，斜率為Vm/Km（米氏常數），進而判斷蒲公英黃酮對酪氨酸酶活性的抑制類型，實驗結果如圖3和表1所示。隨著蒲公英黃酮質量濃度的增大，Lineweaver-Burk雙倒數圖為一組相交于第三象限的直線，直線斜率逐漸增大，Km、Vm都減小。由文獻可知[21]，直線相交于第三象限、Vm值和Km值都減小，但減小的比例不同，表明蒲公英黃酮對酪氨酸酶的抑制類型為混合型抑制。也就是說，蒲公英黃酮作為酪氨酸酶活抑制劑，既可與游離的酶結合，也可與酶與底物的絡合物結合，阻止絡合物分解為產物而抑制黑色素的生成。以米氏方程的斜率和截距對蒲公英黃酮質量濃度作圖（圖3b、3c），分別得到蒲公英黃酮對游離酶的抑制常數KI為0.021 4 mg/mL，對酶和底物絡合物的抑制常數KIS為1.508 mg/mL。

圖3 蒲公英黃酮對酪氨酸酶活性抑制作用的雙倒數曲線

由文獻[22]可知，倒數1/KI可以代表抑制劑（I）與酶（E）的親和力，1/KIS可以代表抑制劑（I）與酶和底物的復合物（ES）的親和力。由表1可知，1/KI＞1/KIS，說明蒲公英黃酮與酪氨酸酶的親和力大于蒲公英黃酮與L-DOPA和酪氨酸酶的復合物的親和力。蒲公英黃酮通過1/KIS、1/KI這兩種親和方式影響酪氨酸酶活性，一方面通過結合酪氨酸酶活性中心以外的其他基團進行非競爭型抑制；另一方面還能通過與L-DOPA和酪氨酸酶結合的復合物反應，進行反競爭型抑制，進一步說明蒲公英黃酮對酪氨酸酶的抑制類型為非競爭型與反競爭型混合的抑制作用。根據文獻[23-24]報道，木犀草素是蒲公英黃酮的主要成分之一，其對酪氨酸酶的抑制機理為非競爭型抑制，抑制常數KI為86 mmol/L。推測蒲公英黃酮中可能含有某種或某些成分對酪氨酸酶的抑制作用為反競爭型抑制，通過與木犀草素等共同作用，使蒲公英黃酮提取物對酪氨酸酶的抑制表現為混合型抑制類型。

表1 酪氨酸酶抑制動力學參數

2.4 體外抗氧化活性

蒲公英黃酮對DPPH+清除結果如圖4所示。隨著蒲公英黃酮質量濃度增大，清除作用逐漸增大。蒲公英黃酮質量濃度為200 μg/mL時，DPPH+的清除率達到89.35%，與陽性對照VC的清除率接近，表明蒲公英黃酮具有較好的清除自由基的能力。這與張坤等[25]研究報道的蒲公英總黃酮質量濃度為9.6 mg/mL時，對DPPH自由基清除率達到80.39%的結果相近似。此外，蒲公英黃酮與常用的天然抗氧化劑茶多酚相比，也具有較好的抗氧化性能，如文獻[26]報道，綠茶提取物質量濃度400 μg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到60%。酪氨酸酶的抑制機理可能與抗氧化作用有關，蒲公英黃酮的抗氧化活性也可能與酪氨酸酶的抑制機理相關。

圖4 蒲公英黃酮對DPPH+的清除作用

3 結論

蒲公英是一種具有多種功效的藥食兩用植物，用體積分數70%乙醇可以有效提取蒲公英黃酮。在試驗質量濃度范圍內，蒲公英黃酮可以有效抑制酪氨酸酶的活性，其半抑制濃度（IC50）約2.5 mg/mL，抑酶活性略高于陽性對照熊果苷。蒲公英黃酮對酪氨酸酶的抑制作用表現為可逆的非競爭型與反競爭型結合的混合型抑制類型，即蒲公英黃酮通過與酶和酶-底物復合物結合的方式抑制酶活。由動力學參數可知，兩種抑制酶活方式相比，蒲公英黃酮對酶的親和能力更強。此外，蒲公英黃酮具有較好的抗氧化性能，其對酪氨酸酶的抑制作用可能與抗氧化性能有關。蒲公英是安全性極高的天然產物，且價格低廉、取材廣泛，可深入進行研究開發具有美白、抗氧化等多種功效的蒲公英黃酮及其日化產品。