表面增強拉曼散射技術在蛋白質類物質檢測中的研究進展

韓子，郭曉東，王元鳳，魏新林*

1.上海交通大學農業與生物學院（上海 200240）；2.上海師范大學生命科學學院（上海 200234）

蛋白類物質的檢測被廣泛應用于醫療診斷、食品及環境檢測等領域。其常用的檢測方法包括酶聯免疫吸附反應（ELISA）[1]、電化學[2]、基于熒光的蛋白質微陣列[3]等。然而，傳統的蛋白質檢測方法需要消耗大量材料，操作復雜、產量低，影響在實際檢測中的應用[4]。

拉曼散射現象推動檢測技術的革新，但較弱的拉曼效應及低靈敏度阻礙其大規模發展；表面增強拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）技術的發現在增強拉曼信號方面提供了新的解決思路。SERS技術基于貴金屬的聚集效應，將待測分子吸附在納米級粗糙金屬表面，使得入射光激發金屬表面電子產生更強烈的共振，極大地增強了拉曼信號[5]。隨著研究日益深入，SERS技術成為小分子、大分子蛋白質甚至細胞生物分子分析必不可少的超靈敏分析工具，它可以通過分子的拉曼指紋圖譜實現對待測分子的無標記檢測[6]。對SERS技術的發展及原理進行概述，對SERS及其聯用技術在蛋白質類物質檢測中的應用進行介紹，為建立基于SERS的蛋白質檢測方法提供參考。

1 拉曼散射、表面增強拉曼（SERS）光譜及SERS基底

1928年，拉曼等[7]發現散射光波長相對于入射光發生改變，該現象因此被命名為“拉曼散射”。由于拉曼散射是入射光子（h）的非彈性散射，能夠因其特征分子振動的能量而在頻率上發生位移（圖1a）；依據散射后波長的增加或降低，可分為斯托克斯散射（h1）和反斯托克斯散射（h2）[8]。1974年，Fleischmann等[9]發現粗糙銀電極上吡啶產生的拉曼信號有所增強的現象，即表面增強拉曼散射（SERS）。其原理圖如圖1（b）所示。SERS效應產生的原理被認為是由電磁增強和化學增強介導的[10]。電磁增強理論認為，入射光可以激發納米金屬表面的電子產生局域表面等離子體共振（LSPR）；而化學增強（電荷轉移效應）機制具有一定的限制性，只適用于能與金屬表面形成化學鍵的物質[11]。材料的尺寸、形狀、顆粒間距及介質環境均會影響LSPR強度[12]進而影響SERS效應，因此，選擇合適的SERS基底尤為重要。

圖1 拉曼散射的原理[13]（a）和表面增強拉曼散射（SERS）的原理[14]（b）

為擴大表面增強拉曼光譜技術的應用規模，該技術的靈敏度、重復性、穩定性、基底成本和制造的簡易性等問題亟待解決[15]。SERS活性納米的結構由2種類型的基質組成：基于固體表面的基質和基于膠體的基質[16]。固相的SERS基底有助于制備高度增強信號的表面金屬納米結構，如將納米顆粒直接沉積在氨基硅烷涂層表面或利用納米光刻技術、電子束光刻技術等制備納米三角陣列或納米球[17]；金或銀的納米顆粒液相體系也是常用的SERS基底，與固態基底相比表現出了更好的分散均勻性[18]。基于對固相及液相SERS基底的改進將有助于開發檢測性能更高的SERS技術。

作為一種強大的分析及成像工具，SERS圖譜可以提供更加豐富的振動光譜信息，使其在食品分析、藥物分析、生物醫學方面獲得廣泛應用[19-25]。根據檢測方法的不同，基于SERS的蛋白檢測可以分為兩類，一類是SERS直接檢測法，另一類是基于SERS的聯用技術。

2 SERS直接檢測技術

直接法是SERS中最簡單常用的方法，可獲取與等離子體材料直接接觸的目標分析物的SERS光譜，同時能獲取蛋白質振動光譜中的信息；該種方法靈敏度高，某些情況下甚至可以檢測到單分子[26]。

通過SERS檢測蛋白質的策略是基于目標蛋白存在條件下貴金屬膠體的化學或物理聚集，納米簇聚集產生的交互效應可以產生較高的電場強度，這些以高電場強度聚集的局部區域被稱為“熱點”[27]。貴金屬納米粒子因具備良好的等離子體共振效應及易于調諧的幾何學性質，能夠提供豐富的“熱點”，常被用于基于SERS技術的檢測。Chen等[28]開發金納米棒（Au NR）修飾的氧化石墨烯作為底物，以裸露的Au NRS為探針的新型夾心免疫結構為SERS基底，用于腫瘤標志物癌胚抗原（CEA）的定量檢測；受到化學和電磁增強的共同作用，檢測限可達3.01 pg/mL。在SERS直接檢測中，納米粒子的尺寸和拉曼照明波長能夠影響金納米粒子及納米等離子體團簇，因而可以通過調整光照波長及選擇合適的金納米團簇模型，防止輻射損耗，進一步優化SERS對蛋白質的檢測[29]。

圖2 SERS直接檢測技術示意圖

3 基于SERS的聯用檢測技術

基于SERS的蛋白質直接檢測方法發展較為成熟，但仍需要昂貴的試劑和儀器，費時費力，需要訓練有素的操作人員等。隨著SERS發展，許多傳統的檢測蛋白質類的方法，如酶聯免疫吸附法（ELISA）、免疫印跡法（MIP），在單獨使用時往往操作復雜、穩定性和重復性不強、干擾因素多、成本高[30]，不適用于基質復雜的樣品等，當與SERS聯用時，將會表現出更好的檢測能力。同時，隨著近年來對臨場檢測及快速檢測的要求，SERS與試紙條及生物芯片的聯用也成為基于SERS的檢測蛋白質類物質的新型手段。

3.1 SERS與酶聯免疫吸附反應（ELISA）聯用

ELISA是一種定量分析方法，通過酶連接的偶聯物和酶底物之間相互作用所產生的顏色變化來表現抗原-抗體反應[31]。傳統的ELISA所用抗原及抗體的制備成本高，質量易受抗原抗體制備方法的影響[32]，需要較為精密的操作，具有一定的局限性。

通常情況下，檢測抗體和拉曼報告分子標記在納米粒子表面形成免疫拉曼探針，當免疫拉曼探針與抗原結合時，可通過檢測拉曼信號來確定抗原濃度[33]。由于蛋白質是一類大分子物質，在基于SERS的ELISA檢測法中，“三明治”模式是最常見的一種（圖3A）。Yang等[34]制備一種新型的等離子體多層核殼的-衛星納米結構（Au@Ag@SiO2-AuNPs），Au@Ag作為SERS平臺，較高的SiO2層在Au@Ag與AuNPs之間表現出遠程等離子體耦合，進一步導致了拉曼散射增強。此外，還可以利用過氧化氫的還原性來改變金屬納米顆粒以實現超靈敏檢測。Liang等[33]結合SERS和銀納米粒子聚集，ELISA的酶標物質通過控制過氧化氫對拉曼標記銀納米顆粒的溶解，實現抗原-抗體反應，同時，該過程在分析物存在時產生較強的拉曼信號。

3.2 SERS與免疫印跡技術

分子印跡聚合物（MIP）具有特定的識別能力，穩定性好、制備簡單、成本低，與SERS聯用時不需要特殊的標記，因而具備廣泛的應用前景。如圖3（B）所示，MIP材料可作為待測目標蛋白的預濃縮方法，在SERS標簽即金屬納米粒子和拉曼信號分子的作用下，通過抗體與抗原特異性結合以獲得SERS信號[35]。有研究表明，結合MIP可以捕獲糖蛋白、包括SERS報告基因的金屬NPs以及硼酸基結合到蛋白質的糖基化部分來實現蛋白質檢測[36]。Tu等[37]采用金基硼酸鹽親和分子印跡技術從復雜樣品中特異性提取目標糖蛋白，金陣列在激光照射下產生等離子體波，顯著增強SERS信號，分析時間可以縮短至30 min。MIP方法操作較為復雜，定量分析不夠精確，通過與SERS聯用能夠依靠特征性指紋圖譜獲得更為精確的蛋白質定性定量指標，有助于進一步分析鑒定。

3.3 SERS與試紙條聯用

試紙條是一種快速簡便的現場檢測手段，但通常僅作為一種定性或半定量測量的工具，其靈敏度和穩定性仍有待提高。功能化的Fe3O4@Au磁性納米顆粒（MNPs）可對雙重感染生物標記物進行超靈敏分析，而經抗體修飾的Fe3O4@Au MNP能夠作為SERS納米標記感染生物標記物，組裝在側向流免疫層析試紙條時，可實現血液中目標感染生物標志物的定量檢測（如圖3C所示）[38]。Wang等[39]利用Fe3O4@Ag磁標簽與雙層拉曼分子和捕獲目標病毒的抗體結合，可對試紙條上的目標病毒進行特異性識別和富集，對甲型H1N1流感病毒和人腺病毒（HAV）的檢出限可分別達到50和10 PFU/mL。紙基試紙條結合SERS同樣可以實現待測物的快速、靈敏定量分析。有研究表明，將具備多個“熱點”的樹莓型雙金屬Au@AgNP納米結構組裝在箭頭形試紙條上，可以實現對復雜樣品的高靈敏度檢測，且樹莓型的雙金屬納米粒子SERS性能的靈敏度和穩定性均優于球形AgNP[40]。引入SERS技術可極大地提高試紙條的定量檢測及分析的可靠性和靈敏度，有利于實現LFIA的痕量蛋白質檢測。

3.4 SERS與生物芯片聯用

生物傳感器可對蛋白質類物質進行定量檢測，靈敏度較高，選擇性好，適用于現場分析。與生物芯片聯用SERS基底通常是使用刻蝕工藝將模板圖案轉移到人IgG底物上，芯片暴露于等離子體后洗去納米顆粒，將其浸入牛血清白蛋白溶液中，獲得圖案化的蛋白質芯片，用于蛋白質檢測時，將上述芯片浸入標記抗原溶液中即可完成檢測[41]。如圖3（D）所示，一般而言，有序排列的硅納米管（SiNPLs）和等離子體銀納米顆粒（AgNPs）可作為增強SERS信號的有效基底，適用于不同帶電蛋白質甚至特殊的淀粉樣蛋白[42]。然而，對于SERS與生物芯片聯用的報道較少，大部分仍集中在醫學領域。

圖3 SERS與ELISA（A）、免疫印跡（B）、試紙條（C）、生物芯片（D）技術聯用原理圖

4 結語及展望

SERS技術觀察到的拉曼信號比傳統的拉曼散射高幾個數量級，能有效降低使用熒光標記產生的光淬滅及干擾現象，并能夠通過選擇合適的SERS基底實現信號放大，提高對蛋白質類物質檢測的靈敏度。隨著SERS與越來越多的技術聯用，基于SERS的蛋白質類物質檢測的應用范圍逐漸從醫學領域拓寬到環境檢測、食品等領域。

然而，仍有許多技術問題亟待解決。SERS技術應用的瓶頸問題是待檢測的分析物附著的有效“熱點”很少；拉曼基底隨機分布在SERS基底上，導致SERS信號的重現性通常不佳；不均勻的SERS活性底物影響SERS定量分析的準確性；不能同時檢測樣品中的多種蛋白質；SERS基底通常是一次性的，不利于對待測物質的反復捕獲和釋放[43]。

針對上述問題，可將目標聚焦于構建高密度、均勻分布的“熱點”，實現“熱點”內拉曼分子的有效富集。隨著檢測技術的日益完善及更靈敏便捷的檢測方法不斷發展，基于SERS的檢測技術可在醫學、環境、食品等領域得到廣泛應用。