SPE-GC/MS法檢測蔬菜中6種酚類化合物殘留

李根容，余文琴，肖昭競，童蘭艷

1.重慶市計量質量檢測研究院（重慶 401123）；2.國家農副加工產品及調味品質量監督檢驗中心（重慶 401123）

酚類化合物苯酚、對苯二酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚以及4-氯-3, 5-二甲基苯酚作為常用的農藥助劑及農藥中間體，被廣泛應用于農藥行業[1-2]。同時上述酚類化合物也是中高毒性的化學物質，部分屬持久性污染物[3]。我國規定水中揮發酚類（以苯酚計）不超過0.002 mg/L[4]，苯酚、間甲酚在我國水中優先污染物黑名單上，苯酚、4-氯-3, 5-二甲基苯酚則在美國EPA水環境中129種優先污染物名單上。2015年，農業部農藥檢定所起草并發布了《農藥助劑禁限用名單》（征求意見稿），明確規定農藥制劑中禁止使用對苯二酚、苯酚，并規定間甲酚和對甲酚含量不能超過0.1%，鄰甲酚和4-氯-3, 5-二甲基苯酚含量不能超過1%。農藥的大量使用使得蔬菜等農作物不可避免地被農藥中酚類化合物污染。研究蔬菜等農作物中酚類化合物的殘留檢測方法有重要的現實意義。

目前上述酚類化合物的檢測方法有分光光度法[5]、電化學法[6]、液相色譜法[7-9]、氣相色譜法[10]、氣相色譜-質譜法[11-12]和液相色譜-質譜法[13]等。前處理主要采用直接萃取[14]、固相萃取[15-16]和固相微萃取[17-18]等方法，也有采取衍生化操作以提高酚類化合物在氣相色譜或者氣質聯用上響應的應用[19-21]，但是操作較為繁瑣。目前尚未見蔬菜中酚類化合物殘留的相關研究，由于蔬菜樣品基質復雜，故試驗采用固相萃取富集并純化蔬菜中酚類化合物，用氣相色譜質譜聯用選擇性檢測目標化合物，既可保證凈化效果，又能快速高效檢測蔬菜中酚類化合物殘留。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

SHIMADZU QP2020氣相色譜-質譜聯用儀（日本島津公司）：配備有EI離子源和AOC-20i型自動進樣器；SQP QUINTIX224-1CN型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；QT-2A渦旋混勻器（上海琪特分析儀器有限公司）；Jipad-24SPE固相萃取儀（上海旌派儀器有限公司）。

丙酮（農殘級，J.T.Baker試劑公司）；乙腈（色譜純，Fisher公司）；正己烷、甲醇、乙酸乙酯（色譜純，德國Merk公司）；三氯甲烷（AR，重慶川東化工有限公司）；濃鹽酸（GR，國藥集團化學試劑有限公司）；苯酚（CAS 108-95-2，99.90%）、鄰甲酚（CAS 95-48-7，99.57%）、間甲酚（CAS 108-39-4，99.52%）、對甲酚（CAS 106-44-5，99.49%）、對苯二酚（CAS 123-31-9，99.51%）、4-氯-3, 5-二甲基苯酚（CAS 88-04-0，99.55%）：LGC公司。

1.2 標準溶液配制

分別稱取適量各農藥助劑標準品，用乙酸乙酯配制質量濃度為1.0×103mg/L的單一標準儲備溶液，于-18 ℃避光保存。分別取適量單一標準儲備液，用乙酸乙酯稀釋配制質量濃度為10 mg/L混合標準中間溶液（其中4-氯-3, 5-二甲基苯酚質量濃度為20 mg/L，對苯二酚質量濃度為50 mg/L），使用時根據需要稀釋成適當濃度的系列混合標準工作溶液，現用現配。

1.3 樣品前處理

準確稱取10.0 g（精確至0.01 g）蔬菜樣品于50 mL離心管中，加入約20.0 mL水，渦旋混勻后振蕩提取20 min，以5 000 r/min離心5 min，收集所有上清液調節pH 2.0左右，待凈化。

依次用6.0 mL乙酸乙酯、6.0 mL甲醇活化HLB固相萃取小柱，再用6.0 mL水平衡后將上述收集上清液全部上柱富集。再用5.0 mL乙酸乙酯洗脫目標物，加入適量無水硫酸鈉除水，于40 ℃氮吹濃縮至1.0 mL，過0.22 μm有機濾膜上GC-MS測定，同時做試劑空白試驗。

1.4 色譜與質譜條件

色譜條件：SH-Rtx-WAX氣相色譜柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度180 ℃；升溫程序：50 ℃保持1 min，以30 ℃/min 升溫至180 ℃，保持0 min，然后10 ℃/min升溫至245 ℃，保持10 min；進樣模式，不分流進樣；柱流量1.0 mL/min；載氣，高純He，純度≥99.999%；進樣量1 μL。

質譜條件：電子轟擊離子源（EI），電子轟擊能量70 eV，離子源溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度250 ℃；溶劑延遲時間7 min；質譜掃描方式，選擇離子監測模式（SIM）。6種酚類化合物的保留時間、定量和定性離子見表1。

表1 6種酚類化合物的保留時間、定量離子、定性離子

2 結果與討論

2.1 固相萃取小柱的選擇

由于部分高色素含量蔬菜樣品（如韭菜）基質干擾嚴重，為了減少基質引入的干擾，選擇固相萃取小柱凈化提取液。固相萃取凈化一般分為兩種模式，一種為目標化合物保留模式，另一種為雜質保留模式[22]。此次試驗研究的6種酚類化合物具有相似的化學性質，故考慮采取目標化合物保留模式，選擇對比了C18，HLB和PLS三種固相萃取小柱的加標回收率。依次用6.0 mL乙酸乙酯、6.0 mL甲醇活化，再用6.0 mL水平衡后將加標質量濃度為0.5 mg/L的水溶液（pH 2.0～3.0）全部上柱富集。再用6.0 mL上樣溶液淋洗固相萃取小柱，用5.0 mL乙酸乙酯洗脫目標物，加入適量無水硫酸鈉除水，過0.22 μm有機濾膜后上GC-MS測定，結果見圖1。C18固相萃取小柱對于苯酚的回收率偏低（＜70%），對苯二酚在PLS固相萃取小柱的回收率偏低（＜40%）；HLB固相萃取小柱對6種酚類化合物均有較好的回收，故選擇HLB固相萃取小柱進一步優化。

圖1 不同固相萃取小柱對6種酚類化合物回收率的影響（n=4）

2.2 上柱溶液pH的優化

待測6種酚類化合物均帶有酚羥基，在不同pH條件下呈不同狀態，故上樣溶液pH對固相萃取的回收率會產生較大影響，故以回收率為指標，考察了上樣溶液在不同的pH條件下（pH 2.0，4.0，6.0，8.0和10.0）對于目標化合物回收率的影響。圖2表明，隨著pH的升高，6種酚類化合物的回收率均明顯降低，在酸性條件下6種化合物均有較好的回收，且在pH 2.0左右回收率最高，這是由于酚類物質在酸性條件下以中性分子形態，疏水性較強，能在反相柱上有較好的保留，在堿性條件下酚類化合物電離呈離子狀態，親水性增強，無法與反相柱相互作用，導致保留減弱甚至無保留。因此，提取后的上柱溶液應調節pH到2.0左右。

圖2 不同pH對6種酚類化合物回收率的影響

2.3 洗脫溶劑的選擇

在其他條件不變的前提下，考察了三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇4種不同溶劑對6種酚類化合物的洗脫效率，洗脫溶劑用量5.0 mL。由圖3可知，甲醇和三氯甲烷對目標化合物的洗脫效果偏低，乙酸乙酯和丙酮的洗脫效果較好，但是丙酮由于洗脫能力太強，導致上樣溶液雜質含量較多，為了避免丙酮帶入的雜質對檢測定量造成的干擾，選擇乙酸乙酯作為洗脫溶劑。

圖3 不同洗脫溶劑對6種酚類化合物回收率的影響（n=3）

2.4 色譜柱選擇

考察了6種酚類化合物在通用弱極性毛細管柱HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）和強極性毛細管柱H-Rtx-WAX（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）上的分離效果。結果表明，酚類化合物在HP-5毛細管柱上峰拖尾嚴重，峰型矮胖不對稱，在較早出峰的化合物上表現更為明顯。而在H-Rtx-WAX各個組分峰型對稱尖銳。因此，選擇H-Rtx-WAX毛細管柱分析待測物。6種化合物色譜圖如圖4所示。

圖4 6種酚類化合物的GC-MS總離子流圖

2.5 線性范圍和檢出限

采用外標法定量，按照表1配制酚類化合物混合標準溶液，在上述優化條件下上機分析。以6種酚類化合物質量濃度為橫坐標，定量離子對峰面積為縱坐標繪制標準曲線，考察方法的線性范圍。所得的相關系數均大于0.998，以3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限。不同酚類化合物的線性范圍、線性回歸方程、相關系數、檢出限和定量限見表2。

表2 6種酚類化合物的線性范圍、線性回歸方程、相關系數、檢出限和定量限

2.6 準確度和精密度

選擇低色素含量的白菜和高色素含量的韭菜作為代表，準確稱取不含待測6種酚類化合物的空白蔬菜樣品，分別添加0.01，0.10和0.50 mg/kg（其中4-氯-3,5-二甲基苯酚為0.02，0.20和1.00 mg/kg；對苯二酚為0.05，0.50和2.5 mg/kg）的待測酚類化合物，其他步驟同1.3小節，每個添加水平重復進樣6次。結果表明，各農藥助劑平均回收率為74.69%～115.23%，δRSD＜8.05%，表明該方法準確可靠，可滿足蔬菜中酚類化合物殘留檢測的要求，6種待測酚類化合物的添加回收率和δRSD見表3。

表3 6種酚類化合物的添加回收率和δRSD（n=6）

2.7 實際樣品檢測

選取重慶市農貿市場不同的蔬菜樣品作為考察樣品，包括黃瓜、芹菜、韭菜、白菜等不同類型的10個樣品，應用優化好的分析方法對其進行檢測。結果顯示，1個黃瓜樣品檢出苯酚殘留，含量為1.78 μg/kg，其余蔬菜樣品未檢出。雖然僅一個樣品檢出，但是鑒于樣本數量有限，酚類化合物的殘留亦不容忽視。因此相關部門應該加強農藥助劑的管理工作，并重視酚類化合物殘留對農產品造成的污染。

3 結論

此次試驗開發并驗證的固相萃取結合氣相色譜串聯質譜法可以準確高效地檢測蔬菜中6種酚類化合物殘留。試驗證明固相萃取凈化可以減少基質的影響，提高提取效率，并對固相萃取條件進行了優化。該方法適用于蔬菜中酚類化合物殘留量的測定及調查研究，可以為我國農產品安全監管提供依據和技術支持。