超高效液相色譜法測定奶粉中四種常用香料

林正鋒，龐道標，王朝政，徐志偉，禤開智

海口海關技術中心（海口 570311）

香蘭素、乙基香蘭素、麥芽酚和乙基麥芽酚4種香料被廣泛應用于食品工業中[1-3]，大劑量使用香蘭素和麥芽酚等香料可能會對嬰幼兒造成較大危害，人工香料的安全性越來越受到關注[4-6]。GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[7]明確指出半歲以內嬰幼兒配方食品禁止加入任何食用香料。因此，建立高效、簡便、準確的嬰幼兒配方奶粉中四種香料的分析方法對嬰幼兒乳粉質量安全監管有重要的意義。

此4種化合物的檢測方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[8-10]、氣相色譜-質譜法[2,11-12]、光度法[1]、液相色譜-串聯質譜法[13-15]、二維液相色譜法[16]、離子色譜法[17-18]、電化學法[19-21]等。其中液相色譜法是使用最廣泛且較為經濟的分析方法，目前未見采用液相色譜法同時測定奶粉中此4種香料物質同時分析的方法，在其他基質中這4種物質的分析多采用常規高效液相色譜（HPLC）[9,22]，相比HPLC，超高效液相色譜（UPLC）在檢測靈敏度和分析效率上均有很大的優勢[23]。

試驗采用水-醚體系對樣品進行提取，建立超高效液相色譜（UPLC）同時測定嬰幼兒乳粉中香蘭素、乙基香蘭素、麥芽酚、乙基麥芽酚4種香料化合物的方法。該方法具有高效、可靠、易于推廣的優點，希望能夠為相關部門建立相關測定標準提供參考，保障奶粉質量安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、甲酸、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯（色譜純，美國TEDIA公司）；乙酸銨、磷酸（色譜純，美國Merck公司）；鹽酸、氫氧化鈉、無水硫酸鈉（分析純，廣州化學試劑廠）；香蘭素（純度≥98%）、乙基香蘭素（純度≥98%）、麥芽酚（純度≥99%）、乙基麥芽酚（純度≥99%）：美國Sigma公司。奶粉樣品選用4種一段奶粉和6種其他奶粉（其中4種奶粉標記有添加香料），市售，留做加標試驗和實際樣品測試。

1.2 儀器與設備

BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；KQ3200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MS3型渦旋儀（德國IKA公司）；320 R型低溫離心機（德國Hettich公司）；Advantage A10型超純水凈化儀（美國Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 試驗方法

樣品前處理方法：稱取2 g（精確至0.01 g）試樣，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL 50 ℃的水，以3 000 r/min渦旋混勻2 min，冷卻至40 ℃后，超聲提取15 min，超聲頻率為37 kHz，再加入20.0 mL叔丁基甲醚，以3 000 r/min渦旋混勻3 min，再加入10 g無水硫酸鈉除水，以3 000 r/min渦旋混勻2 min，以9 000 r/min離心3 min，吸取3.0 mL上清液轉移至另一離心管中，再加入2.85 mL 1%氫氧化鈉溶液反萃，以3 000 r/min渦旋混勻1 min后，以3 000 r/min離心3 min，用移液器準確移取0.95 mL下層清液至刻度試管中，加磷酸定容至1.0 mL，過0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜測定。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters）；流速：0.4 mL/min；進樣體積：10 μL；柱溫：40 ℃；檢測波長：276 nm；流動相：A相為乙腈，B相為0.5%甲酸水。梯度洗脫程序：0～1.0 min，10% A～25% A，1.0～4.0 min，25% A，4.0～4.1 min，25% A～90% A，4.1～5.0 min，90% A，5.0～6.0 min，90% A～10% A。

1.3.3 數據處理

通過Empower色譜工作站及數據處理系統分析采集分析色譜圖，保留時間定性，外標法定量。試驗結果采用平均值表示，每個試驗平行3次，采用Excel 2010進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 提取體系的選擇

直接用有機溶劑提取奶粉樣品時，其對樣品浸潤效果較差，難以保證提取效果。文獻[13-15]報道奶粉中4種香料化合物檢測采用的提取體系多為水-甲醇體系和水-乙腈體系，由于甲醇、乙腈和水為互溶體系，難以采用液液萃取進一步凈化和濃縮，還需采用成本較高且耗時的固相萃取富集凈化[13-15]。為此，試驗分別考察了一系列水不互溶的有機溶劑對奶粉樣品的提取效果，包括水-二氯甲烷、水-三氯甲烷、水-叔丁基甲醚、水-乙酸乙酯提取體系，其目的是能夠較容易地實現目標物的富集和濃縮。由圖1可以看出，使用二氯甲烷、三氯甲烷作為提取劑時，奶粉容易結塊，提取效率難以保證，而且離心之后提取溶劑在下層，移取不方便；用乙酸乙酯提取，當加入無水硫酸鈉之后，提取體系變黏稠，固化嚴重，渦旋分散效果較差，無法實現有效提取；用叔丁基甲醚提取，渦旋時溶液均勻分散，離心后有機相澄清，液相色譜分析結果表明其對四種化合物提取效果均較好。因此，最終選擇水-叔丁基甲醚為提取體系。

圖1 奶粉樣品在不同提取體系中的提取效果

2.2 四種化合物在水醚兩相的分配情況

受酚類化合物檢測中常用酸堿分配凈化方法啟發[24]，即酚類化合物在酸性條件下微溶于水，較易溶于有機溶劑；而堿性條件下形成鹽易溶于水，難溶于有機相。試驗用鹽酸和氫氧化鈉配制系列pH（pH 1～14）的溶液，各取10 mL與等體積的含1 μg/mL麥芽酚、香蘭素、乙基麥芽酚、乙基香蘭素的叔丁基甲醚充分混合，分別測定兩相中四種化合物的含量，各化合物不同pH條件下在水相中的含量見圖2。在堿性條件下，隨著堿性的提高，四種化合物在水相中的比例增大，在pH＞13的情況下，四種化合物基本都集中在水相中，這可能是四種化合物均呈弱酸性[15]，在高堿性條件下能形成離子狀態，使其在水中溶解性大大提高。籍芳等[25]采用混合型強陰離子交換固相萃取柱凈化富集香蘭素和乙基香蘭素也是利用其具有酚羥基的特性。在酸性和中性條件下，四種化合物在兩相中的分配比例基本保持不變，pH 3時，麥芽酚、乙基麥芽酚和香蘭素在水中的含量約為50%，24%和17%，說明在中性和酸性條件下，叔丁基甲醚無法完全提取這三種目標物。這是由于三種化合物極性較強，極性越強，其在水中的分配越強，液相色譜分析中幾種化合物的出峰順序（圖3）也表明四種化合物的極性由強到弱依次為麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素、乙基香蘭素，楊華梅等[15]發現麥芽酚和乙基麥芽酚的極性較大，導致兩者在普通的C18固相萃取小柱不保留。因此，試驗最終選擇在水-叔丁基甲醚體系提取，同時加入無水硫酸鈉，使水全部轉化為結晶水，從而將麥芽酚、香蘭素、乙基麥芽酚、乙基香蘭素全部轉移至有機相。離心后取上清液，用pH＞13的堿液反萃除去雜質，用磷酸調節pH后進入液相色譜分析。由圖3可以看出，采用堿液反萃后樣品雜峰很少，說明該法凈化具有很好的凈化效果。

圖2 四種化合物在水相中的含量與pH關系圖

2.3 色譜條件選擇

試驗比較了水-乙腈和水-甲醇流動相體系。結果發現，以水-乙腈作為流動相時，四種化合物分離效果明顯優于水-甲醇流動相體系。楊華梅等[15]采用液相色譜-質譜法測定四種化合物水-甲醇流動相體系也存在香蘭素和乙基麥芽酚保留時間重疊嚴重的現象，質譜可通過提取特征離子對進行定性定量。確定水-乙腈為流動相后，考察了乙腈-0.1%乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.5%甲酸、乙腈-1%甲酸、乙腈-0.5%磷酸對四種化合物出峰的影響。結果發現，使用乙腈-0.1%乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.2%甲酸進行分離，色譜峰均存在一定程度的拖尾現象，而使用乙腈-0.5%甲酸、乙腈-1%甲酸、乙腈-0.5%磷酸進行分離，色譜峰無明顯拖尾，但考慮到強酸環境會降低色譜柱的使用壽命，最終選擇乙腈-0.5%甲酸作為流動相。在此色譜條件下，標準品譜圖如圖3（A和D）所示，4 min內能夠實現4種化合物完全出峰且實現基線分離，從而實現快速分離。

圖3 標準溶液和奶粉樣品色譜圖

2.4 線性范圍和定量限

配制系列標準溶液（質量濃度范圍0.05～50 μg/mL），在所確定的試驗條件下進行分析，以峰面積為縱坐標，標準工作液濃度為橫坐標作圖，采用強制過原點建立標準曲線，4種化合物線性關系良好。根據10倍信噪比，并計入試樣量和定容體積，計算定量限。四種化合物的線性方程和相關系數及定量限見表1。

表1 四種化合物的回歸參數和定量限

2.5 加標回收試驗

在上述確定的色譜條件和前處理條件下，進行5個不同濃度水平的添加回收試驗，其回收率與精密度見表2。4種化合物在5種不同添加水平下，其回收率均比較穩定，在80.1%～98.2%之間，相對標準偏差均小于10%，說明該方法檢測穩定性較好。

表2 空白樣品加標回收率和精密度（n=6）

2.6 實際樣品分析

應用該方法對市售10件奶粉樣品進行分析測定。結果表明，3件奶粉樣品檢出乙基香蘭素，含量分別為10.2（成人奶粉），15.6（孕婦配方奶粉）和45.2 mg/kg（較大嬰兒奶粉）；1件奶粉檢出香蘭素，含量為3.60 mg/kg（較大嬰兒奶粉），此4件奶粉標簽中均標注添加相應的香料，檢出值均符合GB 2760—2014的規定。其余嬰幼兒配方奶粉中均未檢出4種香料。

3 結論

綜上所述，試驗建立了超高效液相色譜同時測定奶粉中香蘭素、乙基香蘭素、麥芽酚、乙基麥芽酚四種香料含量的方法。前處理采用水-叔丁基甲醚提取，氫氧化鈉溶液萃取凈化，有效去除干擾物質。結果表明，該方法具有操作簡便、分析效率高、檢測結果可靠等優點，易于推廣，有望為相關檢測標準的建立提供依據。