UHPLC-MS/MS法同時測定啤酒中4種嘌呤

林欽恒，李圣男，鄧遠強，鄭家概

廣東省科學院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東省保健食品功效成分檢測與風險物質快速篩查工程技術研究中心（廣州 510070）

嘌呤是一類由一個嘧啶環(huán)和一個咪唑環(huán)稠和而成的生物堿類物質，主要包括腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤及其衍生物[1]，是生物體內核酸的重要組成部分，在代謝調節(jié)、能量供應、組成輔酶等方面起著重要作用[2]。嘌呤在體內經代謝變化后的產物為尿酸，嘌呤代謝異常或尿酸排泄受阻時會導致血液中尿酸含量過高，從而引發(fā)高尿酸血癥，并可發(fā)展為痛風、高血壓、糖尿病等多種代謝慢性疾病[3-4]。

嘌呤廣泛存在于食品中，食物攝入是人體外源獲取嘌呤的主要途徑[5]。研究發(fā)現(xiàn)，長期大量攝入高嘌呤食物可明顯影響人體血液尿酸水平，增加高尿酸血癥和痛風等疾病的發(fā)病率[6]，限制高嘌呤食物的攝入，并改善飲食結構是緩解相關疾病的重要方式。高嘌呤食物主要集中在消費量較大的畜禽肉類、魚蝦貝類、大豆及蔬菜類等制品[7]。隨著經濟水平的發(fā)展，啤酒等飲料也成為飲食中重要組成部分，研究顯示市售啤酒中的嘌呤物質含量較高，約40～136 mg/L[8]，相關研究也表明，長期飲用啤酒是高尿酸血癥發(fā)作的重要誘因[9]，啤酒與痛風之間存在著較高的依存關系[8]。因而充分了解啤酒中嘌呤含量的數(shù)據(jù)具有重要意義，能為啤酒愛好者和高尿酸血癥患者的科學膳食提供一定指導。

國內外尚未建立啤酒中腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤含量的準確統(tǒng)一的測定方法，而食品中的嘌呤含量的檢測方法主要有高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質譜法[10]、氣相色譜法和毛細管電泳法[5]等，也有報道將嘌呤轉化為尿酸的間接測定法[11-12]。其中，高效液相色譜法最常應用于啤酒等酒類中4種嘌呤的檢測[1,13-14]，具有操作簡便、靈敏度高、成本較低的優(yōu)點，但由于4種嘌呤均屬于弱堿性物質，在C18色譜柱上的保留度較差，而采用紫外檢測器僅依靠保留時間定性，因此該法往往具有分離度差、效率較低、假陽性率高、準確度低的問題。

試驗在相關研究基礎上，應用超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質譜技術，建立同時測定啤酒中4種嘌呤含量的方法，可應用于實際樣品的檢測，為膳食結構中飲用啤酒飲料的合理安排提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 6460A超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質譜儀（美國Agilent公司）；BSA224S電子分析天平（精度0.000 1 g，賽多利斯科學儀器公司）；KQ-2200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WBK-4B電熱恒溫水浴鍋（上海浦東榮豐科學儀器公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）。

腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤標準品（純度＞98.0%，中國藥品生物制品檢定所）；甲醇（色譜純，美國Honeywell公司）；甲酸（色譜純，純度＞98.0%，阿拉丁試劑（上海）有限公司）；三氟乙酸（色譜純，純度＞98.0%，阿拉丁試劑（上海）有限公司）；試驗用水為超純水；其余試劑（均為分析純，購自廣州化學試劑廠）；啤酒樣品（市售）。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取適量腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤標準品，分別置于25 mL容量瓶中，加入水超聲溶解（嘌呤不易溶解于水可加入NaOH或HCl助溶），分別配制成質量濃度約500 mg/L的標準儲備溶液，于4 ℃保存。分別取適量的4種標準儲備溶液，用水稀釋配制成質量濃度約10 mg/L的混合標準儲備液，再進一步稀釋成合適的梯度濃度，制作標準工作曲線。

1.3 樣品前處理

將啤酒樣品超聲脫氣，過濾，取1.0 mL于10 mL具塞試管中，加入0.2 mL三氟乙酸和0.2 mL甲酸，搖勻，置于沸水浴100 ℃下水解1 h，取出，冷卻至室溫，用NaOH溶液調節(jié)pH至中性，加水定容至10 mL，經0.22 μm濾膜過濾，以備分析。若含量太高可依需要用水進行稀釋。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×150 mm，2.7 μm）；流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0.0～5.5 min，0%～6% A；5.5～7.5 min，100% A；7.5～11.0 min，0% A）；流速0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量2 μL。

1.4.2 質譜條件

離子源：帶鞘氣流的電噴霧離子源（AJS ESI）。掃描模式：正離子模式。檢測模式：多反應監(jiān)測（MRM）。離子源參數(shù)：干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速6.0 L/min；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速11.0 L/min；霧化氣壓力40 psi；毛細管電壓4 000 V。

2 結果與討論

2.1 水解條件的選擇

尤玉如等[15]的研究顯示，使用三氟乙酸-甲酸（1∶1）混合液100 ℃水解1 h，啤酒中嘌呤的提取效果最好；陸春梅等[13]研究表明，三氟乙酸-甲酸-啤酒比例0.2∶0.2∶1時，測得的嘌呤總含量最高。因此，在上述研究基礎上，采用三氟乙酸-甲酸-啤酒比例0.2∶0.2∶1，在沸水浴中水解1 h，作為樣品前處理酸水解的條件。

將4種嘌呤質量濃度約1 mg/L的混合標準溶液按上述條件進行水解，重復6次，并通過與未水解的混合標準溶液比對計算平均回收率，考察嘌呤在該水解條件下的損失率。結果顯示，腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤平均回收率分別為95.1%，93.7%，92.5%和94.0%，說明在該水解條件下，游離嘌呤被分解和破壞的程度較小，損失較少，效果良好。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

提高4種嘌呤組分在色譜柱上的分離度有利于數(shù)據(jù)結果的準確度。試驗比較3種實驗室常用的Agilent色譜柱Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×150 mm，2.7 μm）、Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）和SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），結果顯示采用Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×150 mm，2.7 μm）時，4種嘌呤的分離度相對最優(yōu)。在該色譜柱上，考察3種流動相體系：甲醇-含0.1%甲酸和0.5 mmol/L酸銨水溶液、甲醇-0.5 mmol/L乙酸銨水溶液、甲醇-水。結果顯示，采用含0.1%甲酸和0.5 mmol/L乙酸銨水溶液時，腺嘌呤和鳥嘌呤的保留時間均為3.5 min，不能有效分離；采用0.5 mmol/L乙酸銨水溶液時，鳥嘌呤和次黃嘌呤保留時間接近，均為3.7 min；采用甲醇-水作為流動相時，4種嘌呤組分的分離效果相對達到最佳（見圖1）。因此，選擇Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×150 mm，2.7 μm）為色譜柱，甲醇-水作為流動相體系。

圖1 4種嘌呤標準品的TIC色譜圖

2.3 質譜條件優(yōu)化

分別將4種嘌呤質量濃度約1 mg/L的標準溶液在正離子檢測模式下進行電離和一級質譜掃描，得到穩(wěn)定的[M+H]+準分子離子峰后，對其進行二級質譜分析，得到子離子的質量數(shù)，并將在MRM模式下繼續(xù)優(yōu)化子離子的碰撞能量等參數(shù)，使得其響應達到最優(yōu)。最終得到4種嘌呤的最佳質譜參數(shù)，結果見表1，采集得到的MRM色譜圖見圖2。

表1 優(yōu)化的質譜條件參數(shù)

圖2 4種嘌呤標準品的MRM色譜圖

2.4 線性關系、檢出限及定量限

將1.2配制的標準工作溶液進樣分析，分別以4種嘌呤標準品的質量濃度（X，mg/L）為橫坐標，定量離子的峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸分析，得到回歸方程，并按照各組分的信噪比S/N=3對應的質量濃度計算檢出限，以S/N=10對應的質量濃度計算定量限。結果表明（見表2），4種嘌呤組分在各自的質量濃度范圍內和峰面積線性關系良好，相關系數(shù)（r2）均大于0.999，檢出限（LOD）為6.0～12 μg/L，定量限（LOQ）為20～40 μg/L，相比于目前常用的高效液相色譜法，檢測靈敏度得到了提高（文獻[1]檢出限為0.02～0.17 mg/L）。

表2 4種的嘌呤標準曲線、相關系數(shù)、檢出限與定量限

2.5 加標回收率與精密度

選擇合適的啤酒樣品進行嘌呤含量的加標回收試驗。先按試驗條件處理分析測得本底值（n=4），以相對于本底值約50%，100%和150%的3個濃度水平添加嘌呤含量，每個加標水平平行測定6次，并通過校正樣品本底值的方式計算平均回收率，同時計算相對標準偏差（δRSD）。結果如表3所示，加標樣品的平均回收率為80.5%～98.2%，δRSD（n=6）為1.3%～4.2%，說明該方法的準確度符合一般檢測的要求。

表3 加標回收率與相對標準偏差

2.6 實際樣品的測定

采用該方法對購自超市的10種啤酒飲料進行4種嘌呤含量的測定，并通過加和計算總嘌呤含量，檢測結果見表4。其中，10號樣品為菠蘿啤，其原料及工藝和啤酒不同，故嘌呤含量比較低。由表4可知，啤酒（1～9號）中鳥嘌呤的含量最高，占總嘌呤含量的51.9%～65.7%，總嘌呤含量為36.4～60.4 mg/L，說明啤酒屬于高嘌呤食品，飲食中應予以限制。

表4 啤酒中嘌呤含量 單位：mg/L

試驗同時還測定上述10種啤酒飲料未經水解時游離態(tài)嘌呤含量（前處理不加強酸水解，其余同1.3），檢測結果見表5。由表5可知，啤酒（1～9號）的總游離態(tài)嘌呤含量為8.14～13.5 mg/L，其中黃嘌呤含量最高，占總游離態(tài)嘌呤量的51.6%～83.1%。啤酒水解前后，腺嘌呤、鳥嘌呤和次黃嘌呤含量均有不同程度的增加，說明在啤酒中這3種嘌呤主要以結合態(tài)存在，而黃嘌呤的含量水解后卻略有減少，說明啤酒中黃嘌呤幾乎沒有結合態(tài)，含量降低推測系高溫酸水解造成部分損失所致。

表5 啤酒中游離態(tài)嘌呤含量 單位：mg/L

3 結論

建立同時測定啤酒中腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤4種嘌呤含量的分析方法。該方法樣品前處理簡單快速、準確性高、精密度良好，采用UPLCMS/MS分析技術，兼具分析時間短、效率高、選擇性強、靈敏度高的優(yōu)點，結果可靠，實現(xiàn)對啤酒中4種嘌呤組分進行高效準確的分析，適合于實際樣品的檢測，也為研究測定啤酒中的嘌呤組分及其類似物提供可靠的檢測手段和參考依據(jù)。