防己中黃酮類物質(zhì)的測定及在卷煙中的應(yīng)用

李國斌

華寶香精股份有限公司上海分公司（上海 201821）

防己為防己科植物粉防己（Stephania tetrandraS.Moore）的干燥根，性味苦、寒，歸膀胱、肺經(jīng)，為我國常用的中藥藥材，主產(chǎn)于浙江、廣東、廣西、安徽、福建等地，具有利水消腫、祛風(fēng)止痛的功效[1-3]。防己中成分復(fù)雜，含生物堿、揮發(fā)油、糖類、黃酮類等，藥理學(xué)研究試驗表明黃酮類成分為其主要藥效成分，該成分具有改善血液循環(huán)、提高免疫力的作用[4-7]。防己中的活性黃酮類物質(zhì)包括蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚、異鼠李素等，其功效組分的解析及功能的進(jìn)一步利用有待深入研究[8-9]。試驗以不同產(chǎn)地防己藥材為研究對象，對其活性黃酮類物質(zhì)進(jìn)行測定及其在卷煙中的應(yīng)用。

對防己提取物中蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚、異鼠李素的測定方法主要為分光光度法，但分光光度法用于測定單一黃酮物質(zhì)的量或濃度，估算混合物或提取物中總黃酮物質(zhì)含量，不能對各種黃酮物質(zhì)分別定量；薄層色譜法和柱層析法能對多種黃酮物質(zhì)進(jìn)行分離，雖然成本可控，但耗時長，難以控制重復(fù)性和準(zhǔn)確率；高效液相色譜法具有分離效能高、分析速度快、樣品用量少等優(yōu)點，是應(yīng)用最廣也最適用于黃酮物質(zhì)的分離測定方法。

試驗采用高效液相色譜、梯度洗脫及靈敏度更高的DAD檢測建立防己提取物中5種黃酮物質(zhì)的測定方法，并對其精確度、回收率等進(jìn)行評價；比較不同來源防己提取物對其5種黃酮物質(zhì)含量的影響，以期為防己提取物的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

美國瓦里安PROSTAR230高效液相色譜儀（配有輸液泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、在線脫氣裝置及化學(xué)工作站）；高速萬能粉碎機(jī)（濰坊市精華粉體工程設(shè)備有限公司）；離心機(jī)（盧湘儀集團(tuán)）；渦流混合器；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒公司）；AL2002電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；0.45 μm及0.22 μm針頭微孔濾膜過濾器、乙酸（色譜純）、甲醇（色譜純）（均購自美國TEDIA公司）；Biocel型密理博超純水系統(tǒng)（美國密理博公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及流動相的制備

1.2.1 黃酮物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品

蘆丁（純度≥99.0%）、槲皮素（純度≥99.0%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（純度≥99.0%）、山奈酚（純度≥99.0%）、異鼠李素（純度≥99.0%）（均購自Flucker公司）。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液

以密理博超純水配制黃酮物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度0.1 mg/mL，并于4 ℃冰箱儲存；分別取以上標(biāo)樣液，用密理博超純水配制成質(zhì)量濃度分別為0.1，0.5，1.0，10.0，100.0，200.0，500.0和1 000.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品工作液，于4 ℃冰箱儲存。流動相A相，0.25%乙酸水溶液；流動相B相，90%甲醇水溶液。

1.3 色譜分析條件

SYMMETRYSHIELD RP18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），采用梯度洗脫，洗脫程序為：0～5.0 min，90%～80% A；5.0～35.0 min，80%～0% A；35.0～40.0 min，0%～90% A。進(jìn)樣量10.0 μL；流速0.80 mL/min；DAD檢測波長282 nm；柱溫40 ℃。

1.4 防己提取物樣品處理

防己提取物的配制：分別稱取2.000 0 g水提法得到的廣東潮州產(chǎn)防己提取物、廣西崇左防己提取物、湖南郴州產(chǎn)防己提取物、湖北潛江產(chǎn)防己提取物，用40 mL 90%甲醇水溶液，溶解于100 mL棕色容量瓶中，置于搖床上振蕩提取40 min；靜置10 min，將有機(jī)相層轉(zhuǎn)移并在25 ℃定容到100 mL后，儲存于1～4 ℃冰箱，用前稀釋到所需濃度。

1.5 供試樣品溶液的制備

將1.4小節(jié)得到的提取液以濾紙過濾，將濾液用90%甲醇水溶液定容于25 mL容量瓶，搖勻后0.45 μm濾膜過濾，以10 000 r/min離心10 min后再用高效液相色譜分析，外標(biāo)法定性定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品和供試樣品色譜圖

基于該方法的色譜條件結(jié)合DAD檢測器對5種黃酮類物質(zhì)標(biāo)樣進(jìn)行最大吸收光譜掃描，掃描波長190～400 nm。分析不同黃酮類物質(zhì)的最大吸收光譜，5種黃酮類物質(zhì)在282 nm左右均有較大吸收峰，因此，選取282 nm作為黃酮類物質(zhì)的定量檢測波長。按照方法提供的液相色譜分離和分析條件，分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和廣東潮州產(chǎn)防己提取物、廣西崇左防己提取物、湖南郴州產(chǎn)防己提取物、湖北潛江產(chǎn)防己提取物供試樣品溶液各10.0 μL，自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，分析結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，色譜峰尖銳，各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.7，理論塔板數(shù)均大于3 400，滿足黃酮類物質(zhì)定量要求。

圖1 黃酮類物質(zhì)混合標(biāo)樣（A）和廣東潮州產(chǎn)防己提取物樣品液相色譜圖（B）

2.2 檢測方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍及檢出限

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別稀釋0，5，10，20，50和100倍，吸取6種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 μL進(jìn)行測定。以各色譜峰峰面積積分值（Y）對其濃度（X）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，5種成分至少在0.03～200 mg/L的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.990 0），檢出限（S/N=3）在0.004～0.04 mg/kg，回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 黃酮類物質(zhì)的線性關(guān)系（n=6）

2.2.2 精密度試驗

精密吸取10.0 μL標(biāo)準(zhǔn)品，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄5種組分的峰面積，計算得蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚和異鼠李素的δRSD（n=6）分別為2.97%，1.76%，3.11%，2.47%和2.97%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗

取廣東潮州產(chǎn)防己提取物供試樣品溶液，在0～24 h內(nèi)每隔2 h進(jìn)樣1次，分別記錄5種組分的峰面積，計算得蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚和異鼠李素的δRSD（n=6）分別為2.36%，3.77%，3.62%，2.85%和1.42%，表明供試樣品溶液中5種組分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性試驗

精密稱取6份廣東潮州產(chǎn)防己提取物樣品，制備供試樣品溶液，在高效液相色譜下測得蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚和異鼠李素的δRSD（n=6）分別為3.36%，2.66%，3.29%，2.64%和3.25%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.5 加標(biāo)回收率試驗

取6份廣東潮州產(chǎn)防己提取物（蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚和異鼠李素含量分別是92.82，12.53，9.78，31.89和16.48 mg/kg，總計黃酮物質(zhì)含量為163.49 mg/kg），每份3.00 g，精密稱定，置于50.0 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入3個不同濃度的蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品（10.0，50.0和100.0 mg/kg），按照前述制備供試樣品溶液，在高效液相色譜的色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率的結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚和異鼠李素的平均回收率（n=6）分別為87.76%，89.45%，105.27%，102.36%和89.33%；δRSD（n=6）分別為2.18%，1.30%，2.55%，2.45%和3.34%。

表2 防己提取物加標(biāo)回收試驗結(jié)果

2.3 實際樣品檢測結(jié)果

分別取上述防己提取物樣品，制備供試樣品溶液，在高效液相色譜下進(jìn)樣測定，計算5種組分的含量，結(jié)果見表3。

不同防己提取物中蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚、異鼠李素總含量由高到低為防己（廣東潮州）＞防己（湖北仙桃）＞防己（湖南郴州）＞防己（湖北潛江）。

3 防己提取物在卷煙中的應(yīng)用

廣東潮州產(chǎn)防己提取物、廣西崇左防己提取物、湖南郴州產(chǎn)防己提取物、湖北潛江產(chǎn)防己提取物分別在卷煙中按加表香的形式添加0.01%，儲放2 h后，制備成卷煙，進(jìn)行感官評價，其結(jié)果如表4所示。

表4 不同防己提取物在卷煙中的作用評價

4個地區(qū)產(chǎn)的防己提取物都有增加煙氣濃度、香氣量和厚實性的效果，不同地區(qū)防己提取物香味和口感有所不同，廣西崇左產(chǎn)防己提取物會帶點青滋香，偏酸，尖刺會表現(xiàn)出來；湖南郴州產(chǎn)防己提取物濃度、爆發(fā)力更強(qiáng)，煙氣也會粗獷些，同時喉部會刺激大；湖北潛江產(chǎn)防己提取物濃度、香氣量和厚實都有所增加，但煙氣顯得沉悶些，余味干凈度不夠；廣東潮州產(chǎn)防己提取物綜合指標(biāo)比較好，沒有明顯的負(fù)面作用。

以廣東潮州產(chǎn)防己提取物在不同檔次卷煙中添加不同用量進(jìn)行比較，選擇最佳投放量和應(yīng)用效果。按添加量0.005%，0.010%，0.015%和0.020%分別加入中檔和高檔卷煙進(jìn)行對比評價。在中檔卷煙中，添加量0.005%時，濃度、香氣量略有增加，細(xì)膩度較好，口感較舒適；添加量為0.010%和0.015%時，增加濃度、香氣量和厚實性差別不明顯，口感也無明顯差異，添加量為0.015%時體現(xiàn)防己提取物的個性香味稍微高一點；添加量為0.020%時，防己提取物的個性香味顯現(xiàn)，但有一點抑制煙草本香的負(fù)面效果，有變粗、濃的趨勢。中檔卷煙一般追求濃度、香氣量和滿足感，總之防己提取物添加量為0.010%和0.005%時效果均不錯，但添加量0.010%更合適中檔卷煙。高檔卷煙一般要求香氣質(zhì)高、香氣量足，口感好，故在高檔卷煙中防己提取物添加量0.005%效果最佳，香氣優(yōu)雅細(xì)膩諧調(diào)，口感也較好。

4 結(jié)論

試驗采用高效液相色譜法同時測定防己提取物及不同來源得到的防己提取物中蘆丁、槲皮素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、山奈酚、異鼠李素5種黃酮物質(zhì)的含量，初步比較不同提取方法對5種黃酮物質(zhì)含量的影響。檢測方法顯示，5種成分至少在0.03～200 mg/L的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.990 0）；檢出限（S/N=3）在0.004～0.04 mg/kg，加標(biāo)回收率在87.76%～105.27%，檢測方法靈敏有效。相對而言，廣東潮州產(chǎn)防己提取物的功效最為明顯，這與對黃酮物質(zhì)中含量的試驗結(jié)果一致。

不同來源防己提取物在卷煙中的功能作用基本類似，都有增加香氣量、濃度和厚實度的效果，但是刺激性和余味上及煙氣的細(xì)膩度上表現(xiàn)有所差異。相對來說廣東潮州產(chǎn)防己刺激性增加不明顯，余味還保持較干凈舒適，煙氣細(xì)膩度較好，綜合品質(zhì)及在卷煙中的應(yīng)用價值比較高。通過在不同檔次卷煙中不同添加量的試驗，防己提取物在中檔卷煙中添加量為0.010%時最佳，在高檔卷煙中添加量0.005%最佳。