DABS-Cl柱前衍生HPLC測定發芽糙米粉中γ-氨基丁酸

杜金鳳，郭航宏，陶曉杰，張念潔，宋鑒達

延邊朝鮮族自治州產品質量檢驗所（延吉 133000）

糙米是稻谷脫殼后不加工或者較少加工所獲得的全谷米粒，富含豐富的膳食纖維、維生素和礦物質，由米糠、胚、和胚乳三大部分組成，是一種功能性食品[1]。糙米在一定的工藝條件下萌發生芽，經加工干燥后會得到具有活性的發芽糙米，糙米在發芽過程中會激活并釋放蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶等生物活性成分，能催化蛋白質、淀粉、纖維素等功能物質的富集和轉化。經研究發現，稻谷發芽會激活稻米中的谷氨酸脫氫酶，谷氨酸脫羧酶水解產生的蛋白質形成的谷氨酸中含有大量的γ-氨基丁酸[2-3]。

γ-氨基丁酸（GABA）是一種天然存在的非蛋白質氨基酸，廣泛存在于動物、植物、真菌等各種生物體內。現代醫學研究表明，γ-氨基丁酸（GABA）具有降三壓、緩解心率[4-6]、鎮靜神經、預防老年癡呆、抗腫瘤、排毒、增強免疫力等功效[7-9]，具有很高的保健價值和醫用價值。

目前，國內外關于發芽糙米粉中γ-氨基丁酸含量的測定方法主要有比色法[10]、高效液相色譜法、毛細管電泳法、氨基酸分析儀法[11-13]等。其中比色法、薄層色譜法操作簡單，成本較低，但發芽糙米粉樣品成分復雜，含有多種游離氨基酸，能與顯色劑發生化學反應，比色時容易產生干擾，影響測定結果，毛細管電泳法實驗操作過程復雜、氨基酸自動分析法的分析儀器價格比較昂貴，限制其使用。高效液相色譜儀具有測定結果準確、檢測效率高等優點而被廣泛應用。由于γ-氨基丁酸本身對紫外光吸收小，一般需要衍生化后才能被用紫外或熒光檢測器檢測。國內外常采用的衍生試劑有2, 4-二硝基氟苯（FDNB）、鄰苯二甲醛（OPA）-巰基乙醇、異硫氰酸苯酯（PITC）等[14-17]，但存在反應條件苛刻、樣品前處理復雜、衍生產物不穩定、試劑毒性大等缺點[18-19]。試驗采用4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）[20]為衍生試劑柱前衍生，通過HPLC測定發芽糙米粉中的γ-氨基丁酸含量，旨在建立準確高效的發芽糙米粉中γ-氨基丁酸定量分析方法，為發芽糙米粉中的γ-氨基丁酸的含量分析和質控提供理論技術支持。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）標準品（純度99.9%，國家標準物質中心）；無水乙醇（優級純（色譜純，國藥化學集團有限公司）；4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl，美國AAT Bioquest公司）。試驗用水（色譜純，德國CNW Technologies公司）。發芽糙米粉樣品（本單位送檢樣品）。

Aglient-1260型高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器；C18反相柱；TD6M低速離心機（鹽城市凱特實驗儀器有限公司）；精密天平（奧豪斯儀器有限公司）；QL-901旋渦振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；KQ-600DV超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；FZl02微型植物試樣粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 溶液的配制

4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）衍生溶液：稱取20.0 mg 4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯粉末，用乙腈溶解并稀釋至10 mL，過0.22 μm有機濾膜，現用現配。

碳酸氫鈉溶液：稱取0.40 g碳酸氫鈉，用水溶解并稀釋至10 mL，過0.22 μm水相濾膜，現用現配。

50 mmol/L三水合乙酸鈉溶液：稱取6.80 g三水合乙酸鈉，用水溶解并稀釋至1 L，過0.22 μm水相濾膜，備用。

γ-氨基丁酸標準儲備溶液：精確稱取0.01 g（精確至0.000 1 g）γ-氨基丁酸（GABA）標準品，用乙腈稀釋并定容至10 mL，得到質量濃度為1.0 mg/mL的標準溶液a，于-18 ℃貯存在棕色瓶中保存，備用。

γ-氨基丁酸標準工作溶液：取a液，用乙腈逐級稀釋成質量濃度為20，40，60，80和100 μg/mL的標準工作溶液，待測，現用現配。

1.3 樣品前處理

將發芽糙米樣品混勻，縮分至約50 g，用粉碎機充分粉碎后全部過0.250 mm直徑篩，均質，裝入密閉容器中，室溫保存，備用。

1.3.1γ-氨基丁酸提取

準確稱取1 g（精確至0.000 1 g）樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 80%的乙醇溶液，旋渦振蕩2 min，在50 ℃下超聲提取30 min，靜置5 min后，于4 000 r/min離心5 min，上清液轉移至25 mL容量瓶中，樣品殘渣再用10 mL 80%乙醇溶液按上述步驟提取一次，合并兩次上清液，最后用80%乙醇溶液定容，搖勻，用0.22 μm有機濾膜過濾，待衍生化。

1.3.2 衍生化試驗

準確吸取1 mL試樣溶液、1 mL標準工作溶液、1 mL 80%乙醇溶液于10 mL具塞試管中，分別加入0.2 mL碳酸氫鈉溶液和0.4 mL 4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）溶液，旋渦混勻，在70 ℃水浴中衍生反應20 min，冷卻至室溫，用0.22 μm有機濾膜過濾，待測。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：三水合乙酸鈉溶液-乙腈=65∶35（V/V）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL；紫外檢測器：檢測波長438 nm。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的確定

采用二極管陣列檢測器（DAD）對γ-氨基丁酸標準品衍生產物在210～600 nm范圍內進行波長全掃描，所得吸收光譜如圖1所示。衍生產物在438 nm處有最大吸收峰，且此處干擾峰較少，故選擇438 nm為作為γ-氨基丁酸的檢測波長。

圖1 γ-氨基丁酸的全波長掃描吸收光譜

2.2 色譜條件的優化

液相色譜法測定γ-氨基丁酸常用磷酸鹽緩沖溶液-甲醇或者乙酸鈉溶液-乙腈為流動相，研究表明，磷酸鹽緩沖溶液-甲醇為流動相時，需要梯度洗脫，洗脫時間較長，且基線不穩，采用乙酸鈉溶液-乙腈為流動相時，洗脫時間縮短，且基線穩定，分離度高。試驗選用Aglient-C18反相色譜柱對γ-氨基丁酸進行分離，以50 mmol/L三水合乙酸鈉溶液-乙腈（65∶35，V/V）為流動相，流速1.0 mL/min，所得的γ-氨基丁酸標準品、發芽糙米粉樣品、衍生化試劑DABS-Cl的液相色譜圖如圖2所示。發芽糙米粉中γ-氨基丁酸的保留時間為4.637 min，與γ-氨基丁酸標準品的保留時間4.641 min基本保持一致，衍生試劑DABS-Cl的保留時間為3.255 min，基線穩定，對被測物質色譜峰無干擾，分離度高無拖尾，峰型左右對稱，樣品分離時間短，表明該條件下γ-氨基丁酸的分離效果較好。

圖2 不同樣品的色譜圖

2.3 柱前衍生化條件的優化

2.3.1 衍生時間的影響

設定衍生化反應溫度70 ℃，考察不同衍生時間對標準品衍生物峰面積的影響。取1 mL 40 μg/mL的γ-氨基丁酸標準工作溶液，準確加入0.2 mL碳酸氫鈉溶液和0.4 mL 4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）溶液，旋渦混勻，在70 ℃水浴中分別反應5，15，20，25，30，35和40 min，冷卻至室溫，用0.22 μm有機濾膜過濾，每種條件平行試驗3次，根據色譜條件測定，衍生時間對γ-氨基丁酸標準品峰面積的影響結果見圖3。當衍生反應時間為20 min時，進樣后檢測的峰面積最大，隨著反應時間的不斷延長，衍生化產物穩定性降低，峰面積減小，故選擇20 min為衍生反應的時間。

圖3 衍生時間對γ-氨基丁酸標準品峰面積的影響

2.3.2 衍生溫度的影響

設定衍生化反應時間20 min，考察不同衍生溫度對標準品衍生物峰面積的影響。按2.3.1小節，取1 mL 40 μg/mL的γ-氨基丁酸標準工作溶液，準確加入0.2 mL碳酸氫鈉溶液和0.4 mL 4-二甲胺基苯基偶氮苯磺酰氯（DABS-Cl）溶液，旋渦混勻，分別在60，65，70，75，80和85 ℃水浴中衍生反應20 min，冷卻至室溫，用0.22 μm有機濾膜過濾，每種條件平行試驗3次，根據色譜條件測定，衍生溫度對γ-氨基丁酸標準品峰面積的影響結果見圖4。當衍生溫度為70 ℃時，標準品衍生物峰面積最大，且峰面積趨于穩定，隨著反應溫度升高到80 ℃，衍生化產物穩定性降低，峰面積急劇減小，故選擇70 ℃作為衍生溫度。

圖4 衍生溫度對γ-氨基丁酸標準品峰面積的影響

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系考察及檢出限

將1.2.5小節所配制的γ-氨基丁酸標準工作溶液按1.3.2小節的衍生化試驗條件反應，根據色譜條件測定，以γ-氨基丁酸質量濃度為橫坐標，衍生后產物響應值為縱坐標，繪制標準曲線，如圖5所示。γ-氨基丁酸在20～100 μg/mL質量濃度范圍內呈現良好的線性關系，線性回歸方程Y=4.318 8X+9.956 2，R2為0.999 6。以3倍的信噪比（S/N=3）計算方法的最低檢出限（LOD），結果為0.1 mg/kg；以10倍的信噪比（S/N=10）計算方法的定量限（LOQ），結果為0.4 mg/kg。結果表明，該方法靈敏度高，能滿足發芽糙米粉中γ-氨基丁酸的日常檢測、定量和質量控制要求。

圖5 γ-氨基丁酸標準曲線

2.4.2 精密度試驗、重復性試驗和穩定性試驗

精密吸取10 μL衍生后的20 μg/mLγ-氨基丁酸標準溶液，平行進樣6次，記錄峰面積，計算相對標準偏差。連續測定6次的標準品峰面積分別為91.14，92.00，91.93，91.64，90.11和91.93，相對標準偏差（δRSD）為0.80%，表明該方法儀器精密度良好，準確度高。

取發芽糙米粉樣品，按照樣品前處理方法同時制備6份平行樣品溶液測定，以樣品中γ-氨基丁酸峰面積考察試驗重復性。結果顯示，相對標準偏差（δRSD）為0.36%，表明該方法具有良好的重現性。

精密吸取10 μL衍生后的20 μg/mLγ-氨基丁酸標準溶液，分別于0，2，4，6，8，10和24 h進樣，測定γ-氨基丁酸峰面積。結果顯示，γ-氨基丁酸峰面積的相對標準偏差（δRSD）為1.08%，表明該方法在24 h內穩定，具有良好的穩定性。

2.4.3 加標回收率試驗

按試驗方法對空白基質精白米進行加標回收試驗，每個濃度平行試驗6次，按1.3小節的樣品前處理方法制備樣品溶液，并根據色譜條件測定，外標法定量，計算樣品的加標回收率，結果見表1。結果顯示，在3個加標水平下，γ-氨基丁酸的回收率為95.80%，97.39%和97.14%，平均回收率為96.78%，回收率良好，表明該方法下測得的樣品γ-氨基丁酸含量準確可靠。

表1 加標回收率試驗結果（n=6）

2.5 實際樣品的檢測

采用該方法對單位送檢的5批次發芽糙米粉樣品進行測定。每個樣品平行取2份，取平均值作為測定結果。所檢測的5批次發芽糙米粉的γ-氨基丁酸含量分別163.25，158.74，59.23，62.78和209.85 mg/kg。

3 結論

試驗建立了DABS-Cl柱前衍生HPLC測定發芽糙米粉中活性成分γ-氨基丁酸含量的分析方法，采用超聲提取，DABS-Cl柱前衍生化，生成的衍生產物在24 h內穩定，分離度高。該方法前處理簡單、重現性好、分析時間短、無基質干擾、檢測成本低，適用于發芽糙米粉中γ-氨基丁酸的測定。