夫精人工授精精液優化處理后孵育時間與臨床結局的關系探討

鐘 誠

（惠州市中心人民醫院生殖醫學中心 廣東 惠州 516001）

夫精人工授精（AIH）是指通過非性交方式將丈夫精液優化處理，去除精漿，使精子優化獲能后，注入女性生殖道內，從而使精卵自然受精達到妊娠的目的。與體外受精-胚胎移植（IVF-ET）、卵胞漿內單精子顯微注射（ICSI）等輔助生殖技術相比，人工授精因其授精方式更接近自然受孕，故具有操作簡便、手術創傷少、治療費用低廉、患者并發癥少等優點，容易被患者所接受。人工授精臨床妊娠率受女方年齡、男方精液質量等因素影響較大，其中男方因素中，精液優化處理后前向運動精子總數是影響臨床妊娠率的主要因素[1]。本文擬探討精液優化處理后的孵育時間是否與臨床妊娠率存在相關性，從而為臨床實踐提供指導。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月—10月在我院生殖醫學中心行夫精人工授精的不孕不育患者，共200例。記錄男方精液優化處理結束后至行宮腔內人工授精手術間的時間，即精液孵育時間，孵育時間為0～30 min分為A組100例，孵育時間為31～60 min分為B組100例。患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。納入標準：（1）女方年齡≤35歲，時段內的首個人工授精周期；（2）女方至少有一側輸卵管通暢，存在優勢卵泡；（3）男女雙方均符合夫精人工授精的適應證[2]；（4）男方精液優化處理方法為密度梯度離心法。排除標準：（1）男方精液優化處理后前向運動精子（PR）百分率＜90%；（2）男方精液優化處理后前向運動精子總數＜5×106；（3）男女任一方患有嚴重精神疾病、泌尿生殖系統急性感染；（4）男女任一方具有吸毒等不良嗜好。

1.2 方法

1.2.1精液優化處理 男方禁欲2～7 d，于人工授精日當天手淫取精，留取全部精液于無菌取精杯。待精液完全液化后，采用密度梯度離心法對精液進行優化處理。用SpermRinse洗精液將SpermGrad梯度液稀釋成90%和45%兩種濃度梯度液，火焰消毒巴氏吸管，15 mL錐形離心管底部加入1.5 mL 90%梯度液，再在其上部緩慢加入1.5 mL 45%梯度液。最后在45%梯度液的表層再緩慢加入2～4 mL液化后的精液。如患者精液量大于4 mL，則分置于2管含梯度液的離心管中。500 g離心20 min，去除精漿和梯度液，將底部沉淀加入另一支裝有2 mL洗精液的離心管內，混勻，500 g離心5 min。棄上清，將沉淀重懸于0.5 mL洗精液中，同時取5μL樣本，計數精子濃度、總活力及前向運動精子總數。

1.2.2人工授精方法 患者術前排空膀胱，取膀胱截石位，用生理鹽水清洗外陰、陰道，拭凈宮頸分泌物。窺器暴露宮頸，將優化處理后的0.5 mL精子懸液用人工授精導管通過宮頸緩慢注入宮腔內。術后14 d測血β-HCG陽性為生化妊娠，5～6周B超見孕囊確定臨床妊娠。

1.3 觀察指標

（1）女方年齡：分別記錄每例女性患者行人工授精術時的年齡；（2）前向運動精子總數：精液優化處理后，取5μL樣本，運用西班牙SCA全自動精子質量分析儀，按照世界衛生組織（WHO）第五版《人類精液檢查與處理實驗室手冊》標準行精液常規分析，計數精子濃度、前向運動精子百分率等指標，計算前向運動精子總數。前向運動精子總數=精子濃度（106/mL）×優化處理后精子懸液量（mL）×前向運動精子百分率（%）；（3）臨床妊娠率：依據血β-HCG及B超結果確定臨床妊娠例數，計算A、B兩組的臨床妊娠率。臨床妊娠率=臨床妊娠例數/人工授精總例數×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據處理。正態分布的計量資料采用（± s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料用頻數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 兩組女方年齡、精液優化處理后前向運動精子總數比較

兩組女方年齡、精液優化處理后前向運動精子總數比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組女方年齡、精液優化處理后前向運動精子總數比較（ ± s）

表1 兩組女方年齡、精液優化處理后前向運動精子總數比較（ ± s）

組別 例數 女方年齡/歲前向運動精子總數/×106 A組 100 30.71±4.60 14.11±5.97 B組 100 29.93±3.42 15.54±5.51 t 0.732 0.455 P 0.467 0.650

2.2 兩組臨床妊娠率比較

A組臨床妊娠率22.00%，高于B組的10.00%，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組臨床妊娠率的比較

3.討論

近年來，受生活工作壓力增大、環境改變、婚育年齡推遲等因素的影響，不孕不育發病率呈逐年上升的趨勢。有調查顯示，在我國育齡夫婦中，發病率已高達25%[3]。人工授精適用于男方輕度少弱精、精液液化異常、性功能障礙、女方宮頸因素異常、生殖道畸形、免疫性不育、原因不明不育等的助孕治療。雖然人工授精具有操作簡單、費用低、并發癥少、易于被患者接受等優點，但是與IVF、ICSI等助孕方式相比，臨床妊娠率較低。受患者不孕原因等因素的影響，不同的生殖中心治療周期臨床妊娠率差異較大，為5.9%～23%[4]。既往有關夫精人工授精臨床妊娠率影響因素的研究，多側重于臨床相關因素的研究，多提示治療周期數、優勢卵泡數、女方年齡、不孕年限、促排卵方案、子宮內膜厚度等是重要的影響因素[5-7]。

目前，實驗室常用的人工授精精液優化處理方法有上游法和密度梯度離心法。上游法適用于精子濃度及活力等參數較好的精液標本，利用前向運動精子向上游動，從而達到與死精子、畸形精子及白細胞分層分離的目的。密度梯度離心法利用不同成熟階段精細胞密度不同的特點，通過在梯度液中離心，達到分離成熟精子的目的。與上游法相比，密度梯度離心法具有更高的精子回收率，也能更好地分離前向運動精子與精漿雜質等成分。與此同時，相比上游法，密度梯度離心法由于經歷長時間離心的過程，可能會對精子造成潛在的損傷，如精子膜的破壞、頂體不完整，同時死精子比例增高[8]。本文中，兩組精液標本均采用密度梯度離心法對精液標本進行優化處理，兩組精液優化處理后前向運動精子總數差異無統計學意義，臨床妊娠率差異有統計學意義，提示精液優化處理后孵育時間過長，可能會對精液參數造成負面影響，從而影響臨床結局。既往研究均提示精液優化處理后至行人工授精術時間間隔過長，會對精液參數及臨床結局產生負面影響[9-13]。精液優化處理的離心過程對精子損傷造成的負面影響，可能會隨著處理后孵育時間的延長而加劇。精液優化處理后孵育時間過長，精液中氧自由基含量增加，氧自由基通過損傷精子細胞膜、減低線粒體ATP產生從而減低精子運動能力。同時，孵育時間過長，精子DNA碎片率也會相應增高，從而對精子的受精能力產生影響。

綜上所述，夫精人工授精精液優化處理后孵育時間控制在30 min以內，能改善臨床結局?；诒緲颖玖可俚木窒扌?，期待多中心更大樣本量，得出更為確切的結論，以便為實際臨床工作提供指導。