高通量測序與染色體核型分析技術(shù)用于產(chǎn)前診斷的比較分析

朱曉丹，李 超，歐妙玲，張玲華，黃 湘

（佛山市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心 廣東 佛山 528000）

我國每年出生的新生兒中約有100萬人患有不同程度的先天缺陷，約占每年新生兒出生總數(shù)的5%～6%。先天性缺陷一方面會降低人口素質(zhì)，另一方面還會增加患兒家庭的負擔(dān)，消耗大量的社會資源。針對這種情況為了進一步提高我國人口素質(zhì)，降低新生兒出生缺陷率，就有必要對妊娠期孕婦進行產(chǎn)前診斷，明確胎兒可能存在的遺傳性疾病或先天性缺陷。目前，在相關(guān)臨床診斷中比較常用的是染色體核型分析技術(shù)，但是該技術(shù)具有較為明顯的缺陷。近些年來針對傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)以及高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，臨床上開始采用高通量測序技術(shù)進行產(chǎn)前診斷，與傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)相比，該技術(shù)操作相對簡單方便，且能夠在較短的時間內(nèi)得出檢測結(jié)果，具有較高的檢測效率[1-2]。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2020年1月—10月收治的631例高危孕婦，年齡21～43歲，平均年齡（31.29±2.45）歲；孕周最長16～37周，平均（28.23±2.85）周；高齡孕婦156例，無創(chuàng)基因檢測（NIPT）提示高風(fēng)險71例，胎兒超聲異常186例，血清學(xué)篩查高風(fēng)險175例，不良孕產(chǎn)史43例。部分孕婦存在多種產(chǎn)前診斷指征。

1.2 方法

（1）采集樣本。孕周低于28周的孕婦在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)采集30 mL羊水，整個過程嚴格遵循無菌原則以及相關(guān)要求；采用臍靜脈穿刺術(shù)采集孕周達到28周及以上的孕婦的臍帶血2 mL。（2）染色體核型分析。染色體核型分析共使用20 mL羊水或1 mL臍血，采用培養(yǎng)瓶傳代法培養(yǎng)羊水樣本9～12 d，采用外周血淋巴細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)臍血樣本68～72 h。之后收獲、制片、G顯帶，使用Leica-120進行采集圖像，計數(shù)細胞數(shù)20個，分析細胞數(shù)5個。以《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制》ISCN2016中的相關(guān)規(guī)定為依據(jù)描述核型。（3）高通量測序分析。高通量測序檢測共使用10 mL羊水或1 mL臍血，使用美國illumina公司生產(chǎn)的高通量測序儀（型號：NextSeq 500）對羊水及臍血進行檢測，整個檢測過程嚴格按照說明書及相關(guān)規(guī)定進行。

2.結(jié)果

2.1 染色體核型檢測結(jié)果

染色體核型檢測共發(fā)現(xiàn)62例胎兒染色體異常，占比9.81%。50例為染色體數(shù)目異常，此外還發(fā)現(xiàn)7例9號染色體臂間倒位及10例異染色質(zhì)區(qū)長度改變，見表1。

表1 631例高危產(chǎn)婦染色體核型檢測結(jié)果

2.2 高通量測序檢測結(jié)果

高通量測序檢測共發(fā)現(xiàn)96例胎兒含有缺失、重復(fù)片段，占比15.21%。小于5 Mb片段共38段，6例良性片段；32例非良性片段（32/631，5.07%），見表2。

表2 631例高危產(chǎn)婦高通量測序檢測結(jié)果

2.3 染色體核型檢測與高通量測序檢測結(jié)果比較

對于染色體數(shù)目異常胎兒，染色體核型檢測與高通量測序檢測結(jié)果相符合。對于染色體結(jié)果異常胎兒，高通量測序檢測未發(fā)現(xiàn)平衡易位、倒位及正常多態(tài)性中的9號臂間倒位及異染色質(zhì)區(qū)增長。與染色體核型分析相比，高通量測序額外測出32例小于5 Mb片段非良性片段，見表3。

表3 染色體核型檢測與高通量測序檢測結(jié)果比較

3.討論

在本文中染色體核型檢測共發(fā)現(xiàn)2例胎兒染色體異常，占比2.5%，且2例胎兒均為染色體數(shù)目異常；高通量測序檢測共發(fā)現(xiàn)2例胎兒染色體異常，占比2.5%。1例為45, X（1/80，1.25%），另1例為47, XX，+18（1/80，1.25%）。兩種檢查方法相比，結(jié)果一致，但高通量測量未發(fā)現(xiàn)7例9號染色體臂間倒位與10例染色體異染色質(zhì)區(qū)長度改變的胎兒。一般認為，染色體多態(tài)性現(xiàn)象屬于正常變異，歷年ISCN對多態(tài)性種類均有描述，包括及異染色質(zhì)區(qū)長度改變。染色體多態(tài)性中臨床最為常見的臂間倒位類型就是inv（9）（p12q13），倒位區(qū)域包含9號異染色質(zhì)區(qū)[3]。9號染色體臂間倒位攜帶者，一般不會有相應(yīng)的臨床癥狀表現(xiàn)出來。有研究顯示該倒位不會影響生育。不過，大部分相關(guān)方面的專家學(xué)者認為生殖失敗與inv（9）有關(guān)。有增加其他染色體異常的趨勢且可能影響胚胎種植，影響精子的質(zhì)量及功能。其原因在于，即使inv（9）在人群中有較高的攜帶率，但從種類進行分類，屬于結(jié)構(gòu)改變。隨著檢測技術(shù)的更新和對非編碼基因研究的深入，越來越多的學(xué)者認識到inv（9）很可能在細胞分裂中形成配對環(huán)，造成同源染色體配對困難，使染色體分離發(fā)生異常，從而形成異常的配子和合子，導(dǎo)致胚胎發(fā)生染色體非整倍體變異或減數(shù)分裂中異常配子的產(chǎn)生，最終引起流產(chǎn)、不孕不育、死胎及其他癥狀的臨床效應(yīng)[4-5]。

高通量測序技術(shù)與傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)相比，兩者對被檢測物質(zhì)的特異性與敏感性較為一致，并且能夠?qū)θ旧w發(fā)生的微小變異進行精準測量與分析，操作者的個人主觀意念對其影響較小，與此同時結(jié)果具有良好的重復(fù)性。與傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)相比，高通量測序技術(shù)的優(yōu)勢主要在于能夠在較短的時間內(nèi)得到檢測結(jié)果，理論上只需要3 d左右的時間，時間優(yōu)勢明顯[6]。另外，由于檢測前不需要培養(yǎng)羊水，因此可以避免在培養(yǎng)羊水的過程中因意外事件導(dǎo)致整個檢測失敗。在平衡易位/倒位時，如果細胞內(nèi)核算數(shù)量保持正常，并沒有出現(xiàn)異常變化，那么對于實際上存在的異常現(xiàn)象，常規(guī)測序技術(shù)往往無法進行有效監(jiān)測。雖然臨床上可以通過提高測序深度的方法更加準確、有效的檢測平衡易位/倒位，但是其存在成本過高、技術(shù)難度較大、對樣本DNA的質(zhì)量要求高等問題，因此很難在臨床上推廣應(yīng)用該方法。

綜上所述，在產(chǎn)前診斷過程中高通量測序技術(shù)與染色體核型分析技術(shù)均能夠有效檢測出染色體異常的胎兒，但高通量測序技術(shù)無法檢測出9號染色體臂間倒立與異染色質(zhì)增加的多態(tài)性現(xiàn)象及平衡易位、倒位。高通量測序技術(shù)與傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)相比，其優(yōu)勢主要在于能檢測出5 Mb以下的微缺失微重復(fù)，且能夠在較短的時間內(nèi)得到檢測結(jié)果，不用培養(yǎng)羊水細胞，可以在很大程度上提高檢測的成功率。現(xiàn)階段，臨床上可以通過聯(lián)合使用高通量測序技術(shù)與染色體核型分析技術(shù)使胎兒出生缺陷檢測率得到進一步提高，從而最大程度的發(fā)揮出臨床檢測的實際應(yīng)用價值。