基于廣泛靶向代謝組學的瓠瓜果實鮮味差異代謝物分析

魯忠富 李艷偉 汪 穎 吳曉花 吳新義 王 尖 汪寶根 李國景

（浙江省農業科學院蔬菜研究所，浙江杭州 310021）

隨著人民生活水平的不斷提高和蔬菜供求關系的變化，風味已經成為衡量蔬菜產品質量的重要指標。風味（口感）品質主要取決于三方面因素，一是營養成分，如糖、有機酸、氨基酸、維生素等的含量；二是具揮發性的芳香物質，如醇類、醛類、酮類、萜類和酯類以及含硫化合物等的含量及比例；三是蔬菜產品的質地特性，如纖維感、粉質感、汁液率等。不同瓜果蔬菜的風味決定因子差異很大，如西瓜中糖含量的高低顯著影響西瓜的品質及口感，番茄風味主要取決于果實中酸味和甜味的比例，還受一些香味物質的影響（Baldwin et al.，2000；Tieman et al.，2012，2017）。

瓠 瓜〔Lagenaria siceraria（Molina）Standl.〕別名瓠子、長瓜、夜開花、葫蘆等，屬于葫蘆科葫蘆屬一年生草本植物。瓠瓜在我國已有逾7 000年的栽培歷史，常年栽培面積超過13.3 萬hm2，是我國尤其是南方地區重要的特色瓜類蔬菜作物。鮮味是瓠瓜最重要的品質性狀（吳曉花 等，2018）。不同成熟期或不同品種類型瓠瓜內在風味品質差異巨大：瓠瓜幼果期幾乎無味，商品成熟果則呈現較強的鮮味；棒型瓠瓜鮮味較淡，葫蘆型瓠瓜鮮味則較濃。這些鮮味的差異深刻影響了瓠瓜產品的經濟價值。Wu 等（2017）圍繞瓠瓜品質開展研究，發現游離谷氨酸含量對瓠瓜鮮味起重要作用，對139 份自然群體進行游離氨基酸含量的靶向測定并進行全基因組關聯分析，鑒定到17 個與游離谷氨酸含量相關的SNP位點，解釋了60.7%的遺傳變異。然而，由于瓠瓜鮮味為復雜性狀，除游離谷氨酸外其他影響瓠瓜鮮味的物質成分及其遺傳基礎尚不清楚。

由于果實鮮味與外形、產量等易于量化的性狀不同，它是一種能定性“感覺到”，但難于定量描述的品質性狀，且易受品嘗人的主觀影響，鮮味的鑒定和評價難度較大，一直以口感品嘗為主，缺乏精確精準的定量。代謝組學（metabonomics）是對某一生物或細胞在特定生理或發育狀態下所有低分子量代謝物同時進行定性和定量分析的一門新學科，是定量評價果蔬品質的有效途徑之一。本試驗采用超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）的廣靶向代謝組學技術，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分 析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等多元統計分析方法，鑒定不同瓠瓜品種商品成熟期果實中顯著差異代謝物質，找尋影響瓠瓜鮮味的關鍵因子。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

瓠瓜品系I77 和Nanxiu 由浙江省農業科學院蔬菜研究所提供，選擇商品成熟期果實為供試材料，通過前期已經建立的品嘗方法（Wu et al.，2017），對瓠瓜總體口感程度進行評估，每份材料設置3 個重復。具體操作如下：采摘商品成熟期瓠瓜果實，切取果實中間部分，一份用于生食，一份用于蒸煮，由品嘗小組對總體口感程度進行評估，品嘗小組由15 個經驗豐富、味覺和嗅覺正常、年齡在20～60歲之間的成員組成。以鮮味適中的主栽品種杭州長瓜為對照（5 分），0 分代表“幾乎無鮮味”，10 分代表“鮮味極濃”，各成員獨立打分后取平均數。經口感品嘗，I77 鮮味較濃（8 分），Nanxiu 鮮味較淡（3 分）。2 份材料均于2019年9 月種植于浙江省農業科學院蔬菜研究所楊渡基地大棚中。開花授粉后8～10 d 取樣，果實鮮樣分別經榨汁機榨成勻漿置于50 mL 離心管中，存放在-80 ℃超低溫冰箱中。每份材料取3 個果實作為1 個重復，3 次重復。

1.2 樣品前處理方法

瓠瓜果實勻漿經真空冷凍干燥處理，利用研磨儀（MM 400，Retsch）研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；稱取100 mg 樣本粉末，置于1.2 mL 提取液中溶解，4 ℃靜置6 h，為提高提取率，期間需要在渦旋儀上渦旋數次；離心10 min（9870r?min-1，4 ℃），用注射器吸取200μL 上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，轉移到UPLC-MS/MS進樣瓶中。

1.3 色譜和質譜采集條件

數據采集儀器系統主要包括超高效液相色 譜（UPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A）和串聯質譜（MS/MS，Applied Biosystems 6500 QTRAP）。

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 柱（1.8μm，100 mm × 2.1 mm），購自沃特世科技（上海）有限公司，以0.04%乙酸水溶液為流動相A，以0.04%乙酸乙腈為流動相B；洗脫梯度：0 min 時，B 相比例為5%；10 min 內B 相比例線性增加到95%，并維持在95% 1 min；11.0～11.1 min，B 相比例降為5%，并以5%平衡至14 min。流速為0.35mL?min-1，進樣量為2μL，柱溫為40 ℃。所用試劑均購自德國默克公司。

1.3.2 質譜條件 樣品質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式，正負離子掃描范圍為50～1 250 Da，毛細管電壓為5 500 V（正模式）/-4 500 V（負模式），碰撞電壓為-70～70 V；電噴霧離子源溫度為550 ℃，質譜電壓為550 V，簾氣為0.20 MPa，碰撞誘導電離參數設置為高。在三重四級桿中，每個離子對是根據優化的去簇電壓和碰撞能進行掃描檢測（Chen et al.，2013）。

1.4 代謝物定性與定量

基于ABSciexQTRAPLC-MS/MS 檢測平臺采集樣本代謝物質譜信息，與廣泛靶向代謝組數據庫MWDB（metware database）匹配，鑒定樣本中代謝物。通過ABSciexQTRAPLC-MS/MS 檢測平臺，利用三重四級桿質譜的多反應監測模式（MRM）獲得樣本中代謝物峰面積數據，得到代謝物在不同樣本中的相對含量。

1.5 數據分析

將原始數據導入代謝組學處理軟件Analyst 1.6.3 進行去背景噪音及低質量的處理，包括基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化等，處理后的數據進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），再根據變量對分組貢獻值（VIP）的大小、差異倍數值（fold change，FC）、組間變化的顯著性（P＜0.05）進行差異性代謝物的篩選。鑒別差異代謝物的主要數據庫為邁維自建數據庫MWDB（metware database）及代謝物信息公共數據庫，最后根據差異代謝物結果進行PCA、聚類熱圖和代謝通路分析。

2 結果與分析

2.1 不同瓠瓜品系質譜分析模型評估

在三重四級桿質譜的多反應檢測模式（MRM）下對I77 和Nanxiu 樣本進行分離和數據采集，利用Analyst 1.6.3 軟件進行質譜數據處理，獲得各個樣本的總離子流圖（TIC），可見，色譜峰基線平穩，峰分離效果良好，信號穩定（圖1-A～1-D）。采用主成分分析建模方法對所鑒定的402 種代謝物進行分析，發現當PC1=45.08%，PC2=19.24%時，不同品系間能夠明顯分開，同一品系的樣本沒有明顯分離，且3 次生物學重復數據能夠較好地集中在一起（圖1-E）。OPLS-DA 得分圖顯示，I77 和Nanxiu 的代謝物明顯分離，將全部樣品都位于置信區間內，參數R2Y ＞0.99、Q2 ＞0.90，表明各品系之間存在顯著差異（圖1-F）。綜上可見，該模型穩定性較好，儀器分析和數據結果均具有較高的可靠性。

2.2 不同瓠瓜品系間差異代謝物篩選和鑒定

根據OPLS-DA 生成的第1 主成分變量重要性值投影值（variable importance in the projection，VIP）以及t檢驗的P值來篩選組間的差異代謝物（VIP ≥1，且P＜0.05）。VIP 值越大，分類貢獻越大，越能表明差異代謝物對不同瓠瓜品系的影響強度。由表1 可知，I77 與Nanxiu 果實中差異代謝物有66 種，與Nanxiu 相比，在I77 中顯著上調的代謝物數目為31 種，包括氨基酸及其衍生物8 種、酚酸類3 種、黃酮8 種、生物堿3 種以及脂質9 種；顯著下調的化合物數目為35 種，包括氨基酸及其衍生物2 種、酚酸類7 種、核苷酸及其衍生物2 種、黃酮11 種、生物堿2 種、萜類2 種以及脂質9 種（表1）。再利用SPSS 22.0 進行變化差異倍數（FC）分析，FC 值≥4 的共有6 種，分別為9-羥基-10，12-十八碳二烯酸、9S-羥基-10E，12E-十八碳二烯酸、13-羥基-9，11-十八碳二烯酸、月桂酸、谷胱甘肽和L-瓜氨酸。

表1 I77 與Nanxiu 果實中差異代謝物

續表

2.3 差異代謝物聚類分析

采用聚類分析方法對不同品系瓠瓜果實中的差異代謝物進行分析，圖中顏色表示含量，紅色表示含量高表達，綠色表示含量低表達。結果如圖2 和表1 所示，差異代謝物在I77 與Nanxiu中的含量明顯區分，I77 品系中的9-羥基-10，12-十八碳二烯酸、9S-羥基-10E，12E-十八碳二烯酸、13-羥 基-9，11-十八碳二烯酸、月桂酸、谷胱甘肽、L-瓜氨酸、9，10-環氧十八碳二烯酸、N′，N″″，N″″′-對香豆酰阿魏?？Х弱喚?、二氫鞘氨醇以及12，13-環氧十八碳二烯酸等代謝物的含量相對較高。Nanxiu 品系中的黃嘌呤、LPC（18：1）、單酰甘油酯（?；?8：2）異構1、溶血磷脂酰乙醇胺18：1（2n 異構）、4-O-（6'-O-葡萄糖-對香豆酰基）-4-羥基芐醇、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、6-O-對香豆酰基-β葡萄糖、對香豆酸甲酯、毛蕊糖甙、大車前苷、芍藥花青素和鹽酸多巴胺含量較高。

2.4 差異代謝物主成分分析

采用標準化的數據和SPSS 22.0 降維模塊中因子分析功能，對I77 和Nanxiu 中主要差異代謝物進行主成分分析（PCA）。由表2 可知，前5 個主成分累積貢獻率達到100.00%，同時計算得到了5個主成分的因子載荷矩陣，其中，第1 主成分的方差貢獻率為73.34%，具有較大載荷值的物質為：N-乙酰-L-亮氨酸、12，13-環氧十八碳二烯酸、木犀草素-7-O-蕓香糖苷、溶血磷脂酰乙醇胺14：0等；第2 主成分的方差貢獻率為12.30%，芍藥花青素、葫蘆素d-乙酰葡萄糖、23，24-二氫葫蘆素E O-葡萄糖苷等具有較大的載荷值；第3 主成分的方差貢獻率為5.86%，具有較大載荷值的物質為溶血磷脂酰乙醇胺16：0、3-〔（2-氨基乙氧基）（羥基）磷酸〕氧基-2-羥丙基棕櫚酸酯、L-焦谷氨酸等；第4 主成分的方差貢獻率為5.10%，槲皮素7-O-丙二?；禾腔?己糖苷、4-O-葡糖基-4-羥基苯甲酸等具有較高的載荷值；第5 主成分的方差貢獻率為3.40%，C-己糖基-芹菜素O-己糖苷-O-阿魏酰己糖苷、月桂酸等具有較高載荷值。

表2 瓠瓜品質評價因子的特征值、貢獻率及累積貢獻率

2.5 差異代謝物代謝途徑分析

基于KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據平臺對篩選出的差異代謝物進行代謝通路富集分析，其中Rich factor 為差異表達的代謝物中在對應通路中的個數與該通路檢測注釋到的代謝物總數的比值，該值越大表示富集程度越大，P值越接近于0，表示富集越顯著。如圖3 所示，點的大小代表富集到相應通路上的差異顯著代謝物個數，點的顏色表示代謝通路的P值。KEGG 通路富集分析發現差異代謝物主要顯著富集的代謝途徑有4 條，分別為酪氨酸代謝、黃酮類生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成以及次生生物代謝。

3 討論與結論

鮮味在中國飲食文化中占有重要的地位，其最早見于宋朝林洪的《山家清供》中對竹筍“其味甚鮮”的描述，至明清時期，鮮味的概念已經為人們所普遍接受。鮮味是一種復雜的綜合味感，它是人類進食時產生的一種令人滿足、愉悅的鮮美感覺，是人們在飲食中一直努力追求的美味之一。目前鮮味相關研究非常缺乏。尤其是對于大部分的蔬菜作物，尚不清楚影響其鮮味的主要關鍵物質。

近年來，廣泛靶向代謝組學成為鑒定影響果實品質因子的強有力工具，成功應用于不同作物中（Tamura et al.，2018；Wang et al.，2018a，2018b；章智鈞 等，2020）。本試驗使用UPLC-MS/MS 廣泛靶向代謝組學對2 個口感品嘗鮮味差異顯著的瓠瓜品系進行分析，共篩選到66 種顯著差異物質。通過對I77 與Nanxiu 不同品系間差異代謝物進行聚類熱圖比較、差異倍數（FC ≥4）分析以及主成分分析，結果表明：瓠瓜果實鮮味關鍵物質，主要包括脂類（9-羥基-10，12-十八碳二烯酸、9S-羥基-10E，12E-十八碳二烯酸、13-羥基-9，11-十八碳二烯酸、月桂酸、12，13-環氧十八碳二烯酸、溶血磷脂酰乙醇胺14：0）、氨基酸及其衍生物類（谷胱甘肽、L-瓜氨酸、N-乙酰-L-亮氨酸）以及黃酮類（木犀草素-7-O-蕓香糖苷）等。目前越來越多的研究提出并證實了氨基酸及其衍生物類是提供瓠瓜鮮味的主要物質成分之一（劉天天 等，2018；李銳 等，2019；于芳珠 等，2020）。脂類物質能起到復合調味劑的作用，可增強口感、風味和營養成分，使人增強食欲（繆杰和馬惠香，2005）。木犀草素類黃酮化合物具有抗菌和抗氧化活性功能（宋雪嬌 等，2015），可預防果實褐化，保持果實品質。因此推測氨基酸及其衍生物類、脂類和黃酮類等物質可能綜合影響瓠瓜鮮味品質。