泰國清邁蘑菇屬真菌分子系統學初步研究

陳琴，邱家紅，王曉英，金錢榮*

（1.云南森林自然中心，云南 昆明 650224；2.三岔河鎮林業和草原服務中心，云南 大姚，675413；3.金碧鎮林業和草原服務中心，云南 大姚 675400）

蘑菇屬（Agaricus L.）也稱傘菌屬,隸屬于真菌界（Fungi）、擔子菌門（Basidiomycota），擔子菌綱（Basidiomycetes），傘菌目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）。蘑菇屬是一類廣泛分布于世界各地，營腐生生活的重要經濟真菌。生長在森林、草原、田間、地頭、路邊、庭院等地。根據國內外文獻統計，近年來人們采集到和鑒定過的已知的蘑菇屬的種有200～250 種[1]，但是,隨著研究的不斷深入,更多新的物種也將不斷被發現。多數蘑菇屬真菌具有食用、藥用或保健價值,開發價值較高，是理想的天然食品。本研究則是對泰國清邁蘑菇屬真菌進行分子系統學初步研究，這將對該屬真菌的馴化、育種，增加食用菌的品種，蘑菇產品的開發具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試材料

本研究以泰國清邁蘑菇屬標本為主，供試標本為干燥標本，共計8份。標本詳情見表1。

表1 蘑菇屬真菌標本來源表

1.1.2 方法來源

DNA提取試劑盒、PCR擴增所用混合液、rDNA ITS分析物、BM2000 DNA Marker，DM0101(Biomed)。

1.2 實驗用品

用具及儀器：A4繪圖紙、鉛筆、橡皮、小刀、培養皿、鑷子、刀片、載玻片、蓋玻片、電子顯微鏡、高壓滅菌鍋(YXQ-LS-50-SII)、無菌操作臺(AIR TECH)、酒精燈、打火機、移液槍(含槍頭)、PCR 擴增儀(My-CyclerTMthermal cycler，BIO-RAD)、瓊脂糖凝膠電泳儀(DYY-Ⅲ-6B)、紫外成像儀、臺式離心機(eppendorf，Centrifuge 5 417R)、小型離心機、臺式恒溫振蕩 器(AUTO SCIENCE，SWB-2 000 Horizontal Shaking Bath)、制冰機(SIM-F140，SANYO)。

試劑：75 %酒精、95 %酒精、5 %KOH、無水乙醇、TAE、去離子水、蒸餾水、瓊脂糖凝膠等試劑。

1.3 工作程序

1.3.1 DNA的提取

PCR 擴增→PCR 反應體系→PCR 反應程序→PCR 擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測→ITS 序列測定。

1.3.2 ITS序列的系統發育分析

1.3.2.1 序列的訂正

首先在BioEdit 軟件中通過Graph對每條ITS序列的測定結果進行復檢：分別將每個標本菌株的ITS4和ITS5測定的序列進行復檢，經過人工校正排除程序誤讀，最后將ITS4 和ITS5 序列拼接為一條ITS序列。

此外，通過美國國立生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，簡稱NCBI）的網站對所有序列進行Blast，檢查是否所有序列都屬于蘑菇屬真菌，以防測得的序列為非目的屬序列。

1.3.2.2 系統發育樹的構建

從GenBank 上下載參考菌株的DNA 序列作為標準序列以及本研究得到的標本序列構成數據庫，在BioEdit 軟件中通過ClustalX 程序進行初步校對(Alignment)和序列長度處理。利用網絡數據庫T-COFFEE 進行數據的比對，之后再人工進行調整校對。用ClustalX進行相關格式轉換。系統發育分析中，運用PAUP4.0（Phylogenetic Analysis Using Parsimony4.0）中的最大似然法（ML）構建系統發育樹，同時進行1 000次bootstrap自舉法進行檢測，得到系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 DNA的提取結果

本研究成功提取到25份標本的DNA。

2.2 PCR擴增

提出DNA的25份標本中有18份能夠完成PCR擴增，電泳條帶較為明亮，另外7 份樣品（zrl-131、zrl-132、zrl-134、zrl-144、zrl-185、zrl-245、zrl-247）經重復后電泳效果仍不理想，無法測序。

2.3 序列測定

本實驗送檢測序樣品共計18 個,通過設計的引物，有8個樣品（zrl-188、zrl-193、zrl-219、zrl-221、zrl-229、zrl-235、zrl-273、zrl-276）ITS為“-”，無正常的序列，有2 個樣品(zrl-189、zrl-218)測序出現大面積套峰，無法完全讀出。因此測序正常的序列共8 個，其中有一個樣品無序列號（zrl-4049），則正常的序列共7 個，ITS 全區段（ITS1-5.8 s rDNA-ITS2）序列長度在651～664 bp，其中5.8 s 序列是保守序列，基本沒有變化；ITS1 和ITS2 為內含子序列，變化較大。首先，經過NCBI 中的BLAST 程序對所有序列進行比對，發現全部7 個樣品全部屬于蘑菇屬真菌。最終將本實驗測得的7 條序列與GenBank 下載的124 條蘑菇屬真菌及4條外類群真菌的ITS 序列構成系統發育數據（詳見表2）。

表2 構成數據庫的序列情況

續 表

續 表

2.5 系統發育樹

利用網站http://www.phylogeny.fr/對全部135 條序列進行分析，分子系統發育樹，結果如圖1。

由圖1 可以看出，標本zrl-258 屬于Xanthodermatei 組；標 本zrl-160 屬 于Sanguinolent 組；標本zrl-133 屬于TRⅠ組；標本zrl-265 屬于Arvense 組；有3 個標本屬于Minores，分別是zrl-147、zrl-287、zrl-149，其中標本zrl-147與zrl-287屬于同一個種，堿基位點完全相同。

圖1 系統發育樹

3 討論

一是與ITS結合能夠較科學的解決蘑菇屬真菌分類鑒定的問題，避免單靠蘑菇屬真菌形態分類引起的分歧問題。

二是從分子實驗結果與系統進化樹的結果看，本次研究的25份標本，有7份標本具備了分子研究結果并參與到系統進化樹的構成對比結果當中，分別屬于Xanthodermatei、Sanguinolent、TRⅠ、Arvense和Minores五個組，其中Arvense組的蘑菇均可食用，經濟價值較高，由此可后期進行該方面的引種及開發研究。

三是研究對分子數據解決Minores 組真菌的系統發育問題進行了初探，為進一步深入測定其他區段的序列以解決Minores 組真菌的系統發育問題打下了基礎。