天然多糖基可注射水凝膠在組織工程中的研究進展

張潤婧，陳玉潔，蔡 超，陳 震，劉河洲

(上海交通大學材料科學與工程學院 金屬基復合材料國家重點實驗室，上海 200240)

1 前 言

組織損傷或缺失嚴重影響著人類的健康狀況。人體許多重要組織的自我修復能力有限，如軟骨組織作為一種無血管組織，由于缺乏血液供應，從而很難進行自身修復[1, 2]。組織工程技術能有效幫助人類組織和器官進行修復，其基本原理為：將細胞接種至可降解吸收的生物支架上，細胞可進行大量增殖及代謝，同時產生細胞外基質，從而形成新的生物組織，之后將細胞-支架復合物移植到組織缺失處進行體內重構，最終達到修復或者替代組織的目的[3, 4]。傳統的組織工程支架材料需經手術植入，帶來了操作風險與術后感染等問題[5]。針對此問題，微創手術快速發展，可注射性水凝膠材料是目前微創組織移植的優選細胞載體[6]。水凝膠材料由于具備與人體組織相似的三維網狀結構、高溶脹性以及較好的生物相容性，在細胞培養、組織修復等領域展現出巨大潛力[7, 8]。可注射水凝膠可通過注射器注入體內特定位置，其微創性可有效減輕患者的痛苦，提高臨床安全性，還可以利用注射器深入人體組織，填充缺損處的不規則形狀[6, 9, 10]，是當前組織工程支架材料的研究熱點。為滿足組織修復功能及應用需求，理想的可注射水凝膠材料應滿足以下要求：

(1) 生物安全性。可注射水凝膠材料作為生物體植入物，其生物安全性是最基本的應用前提條件之一。支架材料應具有優異的生物相容性，植入體內后可在合適的速率下完成降解[11, 12]。

(2) 操作便捷性。可注射水凝膠材料應在體外或體內的溫和環境條件下，以合適的凝膠化速率發生凝膠化轉變，以便醫療人員進行注射操作[9, 13]。

(3) 機械強度。為滿足組織工程應用的需求，可注射水凝膠在形成凝膠后應該有足夠的機械強度和韌性，以實現對細胞的支撐及負載[14]。

根據水凝膠中聚合物原料的來源，可將其分為天然高分子水凝膠和化學合成高分子水凝膠兩大類。多糖材料作為自然界中廣泛存在的重要天然聚合物，可以在酶催化或特定生物體條件下實現高度降解，其降解產物一般是單糖或者雙糖，不僅具有生物相容性，易被吸收，甚至還可為生命體提供能量[15-17]。因此，多糖類聚合物非常適用于體內植入水凝膠材料的制備。目前，天然多糖基可注射水凝膠材料已經成為組織工程領域的重要研究主題之一[18-21]。

2 可注射水凝膠的多糖基聚合物原料

天然多糖聚合物原料來源廣泛、安全無毒、化學結構易修飾，基于天然多糖的水凝膠材料具有高保水性、可再生性、生物降解性、生物相容性、無毒性等特點，適合作為體內植入的醫用材料[22]。多糖種類繁多，由于官能團及聚合物鏈長的差異，不同種類多糖材料的性質差別很大。近年來，科研人員利用海藻酸鈉、殼聚糖、纖維素和透明質酸制備了多種多糖基醫用可注射水凝膠，取得了大量研究成果[12, 19, 21, 23, 24],上述4種常見天然多糖可注射水凝膠原料的結構與性質總結于表1。

表1 常見天然多糖可注射水凝膠原料的結構與性質

2.1 海藻酸鹽

海藻酸鹽是從植物褐藻中提取出的親水多糖聚合物，是由含有β-1,4-D-甘露糖醛酸的M單元和含有α-1,4-L-古洛糖醛酸的G單元經過糖苷鍵連接而成的天然高分子材料。由于海藻酸鹽具有良好的生物相容性、較高的吸水和保水能力及非免疫原性等優勢，在組織工程中具有廣闊的應用前景[23, 25]。

Yan等[26]以海藻酸鹽為基體，通過鈣離子的原位釋放，并結合羥基磷灰石(HAP)和明膠微球(GMs)的雙重交聯，得到可注射及可生物降解的復合可注射水凝膠。通過成分控制以及體系pH調節，制備出的水凝膠支架表現出優異的力學性能與穩定性。此外，成骨細胞包覆培養測試證實了該凝膠支架在骨組織工程中的潛在應用。通過與抗生素結合使用，凝膠支架展現出對于成骨細胞活性的促進作用。

然而，由于海藻酸鹽的分子量太大，難以降解，且缺乏與氨基酸、蛋白質等反應的結合位點，這些問題在一定程度上限制了海藻酸鹽作為體內移植物的應用范圍[27]。為了進一步增強海藻酸鹽的實用性，研究人員對海藻酸鹽的結構進行修飾，引入更多的活性基團或側鏈分子[28]，成功拓展了海藻酸鹽在組織工程領域的應用。例如，利用高碘酸鈉對海藻酸鹽進行氧化，可生成具有高化學活性的醛基結構。基于此原理，Wei等[29]利用N-羧乙基殼聚糖(CEC)和己二酸的動態反應以及氧化海藻酸鈉的醛基結構，開發出一種基于生物相容性多糖的新型自修復可注射水凝膠。體系中多種動態共價鍵共存的特性賦予該水凝膠優異的力學性能和自修復能力。此外，該水凝膠還具有良好的細胞相容性及細胞釋放能力，在生物工程領域具有廣闊的應用前景。Balakrishnan等[30]在硼砂存在的條件下完成氧化海藻酸鹽與明膠的自交聯，制備出一種快速凝膠的氧化海藻酸鹽基可注射水凝膠。該水凝膠可以與軟骨組織進行良好結合且幾乎沒有炎癥或應激反應的出現。包裹在水凝膠中的軟骨細胞表現出良好的增殖活性和遷移能力，表明該水凝膠有潛力應用于軟骨組織工程的可注射細胞支架材料。Xu等[20]利用金剛烷修飾硫酸酯化海藻酸鈉(S-Alg-Ad)并完成與3,4-乙二氧基噻吩(EDOT)的氧化聚合，生成生物導電聚合物PEDOT∶S-Alg-Ad，通過聚-β-環糊精(Pβ-CD)與金剛烷的主客體作用，形成PEDOT∶S-Alg-Ad/Pβ-CD導電可注射水凝膠。高度動態的主客體作用可促進PEDOT納米顆粒在水凝膠中的重排和堆積，PEDOT之間的π-π堆積及PEDOT與硫酸化聚合物的陰離子-π相互作用可以進一步穩定非共價網絡。包覆在此種水凝膠中的C2C12成肌細胞展現出良好的增殖速率，且利用水凝膠主客體作用的可逆性能實現細胞的有效釋放；更重要的是，此種導電水凝膠還能顯著促進肌管狀結構的形成，有潛力作為可注射生物電極應用于基礎細胞研究及表型藥物篩選等眾多領域。

2.2 殼聚糖

殼聚糖是一種天然堿性多糖，由自然界廣泛存在的甲殼素經過脫乙酰作用獲得[31]。殼聚糖具有良好的生物相容性，能被酶解為低分子殼寡糖、葡萄糖胺等無害產物，不會引發人體組織免疫排斥作用，因此在醫用注射植入與組織工程領域具有巨大潛力[32]。

Kamoun[33]在不使用傳統化學交聯劑的條件下，將兩種多糖衍生物材料——N-琥珀酰殼聚糖與水溶性二醛淀粉進行混合，通過席夫堿反應制備出了一種新型無毒且可生物降解的多糖基可注射水凝膠材料，且提高N-琥珀酰殼聚糖含量有助于獲得更加致密的水凝膠交聯結構、更短的膠凝化時間及更少的水解質量損失。經體外細胞黏附性測試可知，N-琥珀酰殼聚糖除能夠提高水凝膠的生物相容性外，還改善了凝膠表面的親水性，從而增強了水凝膠的細胞黏附性及生物活性。

此外，殼聚糖還具有一定的抑菌作用[34]。Zhao等[35]利用殼聚糖獨特的抗菌性能，制備出一種具備抗菌、抗氧化能力及電活性的可注射水凝膠。該研究將聚苯胺接枝季胺化殼聚糖(QCSP)與聚乙二醇-聚(甘油-葵二酸)共聚物進行混合，在室溫條件下即可發生動態化學鍵交聯，制備出同時具備自修復能力與高傷口黏合力的可注射抗菌水凝膠材料。QCSP中的殼聚糖成分本身具備抗菌能力，并與聚苯胺片段的電活性和抗氧化性產生協同作用，共同促進傷口處的快速愈合。另外，在季銨化殼聚糖聚合物鏈上引入聚苯胺，可降低季銨化殼聚糖的細胞毒性并提高其抗菌活性[36]。通過調整聚合物上的活性氨基含量，水凝膠體系可獲得最優性能。利用水凝膠的原位成膠方法和組織黏附性能，可以快速填充任意形狀的傷口，并與傷口輪廓進行黏合。

殼聚糖與軟骨基質中的糖胺聚糖具有非常相似的化學結構。相關研究表明，殼聚糖基支架可幫助軟骨細胞進行增殖[37]。擁有足夠的力學強度有利于殼聚糖基水凝膠材料在組織工程中獲得更強的實用性。基于此目的，Latifi等[11]模仿人體軟組織中的膠原纖維結構，制備出具有膠原纖維半互穿網絡的殼聚糖基仿生可注射水凝膠。I型膠原蛋白與III型膠原蛋白共同存在于人體的許多軟組織中，研究人員受此啟發，按照人體組織中兩種膠原蛋白的特定比例，將二者共同引入乙二醇-殼聚糖基質。經生物及力學測試可知，此種仿生殼聚糖基水凝膠可使細胞保持良好的存活能力、代謝活性及遷移能力，同時還具備突出的力學性能，其綜合性能可以滿足組織工程的基本實用要求，具有重要的應用價值。

2.3 纖維素

纖維素是由葡萄糖連接而形成的線性天然聚合物，廣泛存在于植物、細菌等生物中，是自然界分布最為廣泛的天然多糖高分子材料[38]，具有天然低毒、易于加工、生物可降解、可再生等優良特性[39, 40]。近年來，圍繞纖維素材料作為組織工程領域植入物的研究與應用受到廣泛關注[24, 41]。

由于纖維素分子鏈上存在大量羥基，易生成分子間氫鍵，從而使纖維素具備出色的化學穩定性及力學性能，可滿足人體組織的生物力學要求，因此非常適合作為組織工程中的支架材料[42]。Yang等[43]利用可溶性纖維素衍生物制備出具有高效自修復能力與雙重環境響應能力的纖維素基可注射水凝膠。他們首先合成了纖維素衍生物羧乙基纖維素接枝二硫代二丙酰肼(CEC-TPH)和二苯甲醛封端聚乙二醇(PEG-DA)，在無毒催化劑4-氨基-DL-苯丙氨酸(4a-Phe)的活化作用下，體系中的酰肼鍵和醛基可形成動態酰腙鍵。動態共價鍵在生理條件下的可逆斷裂重建能力，賦予了水凝膠優異的可注射性能及力學強度。基于纖維素衍生物等原料的低毒性及生物相容性，研究者將成纖維細胞L929包覆于水凝膠內部進行三維培養，細胞可以保持高的細胞活性和增殖能力，表明該纖維素基可注射水凝膠有望成為組織工程中三維細胞培養的有效支架材料。為制備同時具備力學強度與韌性的纖維素基可注射水凝膠，Zhao等[44]利用羥乙基纖維素、木質素磺酸鹽等原料，制備出具有半互穿網絡結構的水凝膠。研究者首先利用化學交聯使丙烯酸與木質素磺酸鹽發生自由基聚合，再利用羥乙基纖維素含有的大量羥基進行分子間氫鍵交聯，最終形成水凝膠的半互穿網絡。此種水凝膠具備突出的力學性能，可滿足生物體承重組織的力學性能要求。

為進一步拓展纖維素基可注射水凝膠的醫用功能，Park等[45]利用羧甲基纖維素與殼聚糖之間的靜電作用，制備出可負載姜黃素微膠囊(Cur-M)的可注射載藥水凝膠(圖1)。陽離子殼聚糖溶液和陰離子羧甲基纖維素通過簡單機械混合即可發生靜電交聯作用，從而形成可在腫瘤內注射的載藥水凝膠材料。利用雙注射器將混合溶液注入小鼠體內后，由體內實時成像結果可知，經皮下注射的水凝膠可在生物體內快速成型，并在體內留存20 d左右。相比于直接注射的藥物，利用多糖基可注射水凝膠包裹的Cur-M可在病變區域表現出更大的分布范圍，從而印證了該水凝膠體系具備的藥物緩釋效果。

2.4 透明質酸

透明質酸(HA)是一種非硫酸化的陰離子親水糖胺聚糖，存在于人體關節軟骨中，可提供潤滑作用并在細胞增殖、分化等過程中發揮重要作用。基于透明質酸的可注射水凝膠由于其獨特的生物學特性而具有作為組織工程支架的巨大實用潛力[46, 47]。

基于透明質酸在軟骨組織中的分布及重要功能，Palumbo等[48]利用氨基官能化的透明質酸衍生物(HA-EDA-C18)與二乙烯基砜官能化的菊粉(INU-DV)制備適合軟骨細胞增殖的可注射水凝膠支架，在生理環境下發生偶氮-邁克爾加成反應，制備出對酶水解具有較高抵抗力且具有彈性的可注射水凝膠，細胞培養結果表明，軟骨細胞在HA-EDA-C18/INU-DV水凝膠中培養1 d后便可進行有效增殖。為提高視網膜祖細胞(RPC)的增殖和分化能力，Tang等[21]利用邁克爾加成反應制備出明膠-透明質酸凝膠(Gel-HA)，并進一步模仿貽貝結構，引入聚多巴胺(PDA)，制備出Gel-HA-PDA凝膠。該工作研究了透明質酸基水凝膠對RPC生物學行為的影響。結果表明，Gel-HA水凝膠可利用RPC細胞簇，促進細胞增殖，而Gel-HA-PDA水凝膠可顯著增強RPC的黏附和遷移能力，并誘導RPC優先分化為視網膜神經元，從而為視網膜生物醫學材料的研究提供了新思路。

考慮到注射型植入材料的實用性，Feng等[49]針對水凝膠在注入人體后凝膠化速率有待提升的問題，提出了一種載有干細胞的新型微凝膠的概念。此種微凝膠可以通過微創方式注射到軟骨缺損部位并實現自組裝，有望應用于體內的軟骨組織工程修復領域。該工作首先合成了巰基化的明膠(Gel-SH)和乙烯基磺化的透明質酸(HA-VS)，然后基于液滴微流控方法，將Gel-SH、HA-VS和骨間充質干細胞(BMSC)混合，利用快速有效的硫醇-邁克爾加成反應，在20 s內即可完成快速凝膠，生成富含干細胞的明膠-透明質酸微凝膠(Gel-HA)。Gel-HA微凝膠提供的優異微環境促進了細胞的迅速增殖，還能通過細胞間的相互連接，誘導微凝膠自組裝成類似于軟骨組織的大孔支架，促進了物質運輸及軟骨修復。Gel-HA可注射微凝膠的概念及其簡單有效的合成方法，為組織工程和再生醫學材料提供了全新的設計思路。

3 可注射水凝膠的設計方法

根據可注射水凝膠的設計及制備機理，可將可注射水凝膠主要分為基于物理交聯的可注射水凝膠與基于化學交聯的可注射水凝膠。各類可注射水凝膠的設計方法總結如圖2所示。

3.1 基于物理交聯的可注射水凝膠

利用物理交聯方法形成的可注射水凝膠主要依靠聚合物的分子間弱相互作用力形成聚合物交聯網絡，如氫鍵、靜電相互作用、主客體相互作用等[45, 50, 51]。此類材料在注射前呈流動性液體狀態，一旦注入人體，即可利用溫度、pH等物理條件的變化，在生理條件下迅速完成溶膠-凝膠轉變，無需任何化學引發劑。

溫度敏感性可注射水凝膠是指，環境溫度的變化可以影響水凝膠網絡中聚合物鏈之間的親疏水性及氫鍵的相互作用，從而實現凝膠化轉變。溫度敏感性可注射水凝膠存在一個最低臨界溶膠-凝膠轉變溫度，當環境溫度低于這一溫度時,聚合物分子鏈上的親水基與水分子通過氫鍵作用進行連接，體系呈溶膠狀態；當注入人體后，溫度升至最低臨界溶膠-凝膠轉變溫度以上,疏水作用成為主要作用力,高分子鏈通過疏水作用互相聚集，聚合物從優先聚合物-水的相互作用狀態轉變為優先聚合物-聚合物的相互作用狀態，從而發生凝膠化相變(圖3)[9, 52]。利用天然多糖制備的溫敏性材料具有良好的生物相容性及簡便的凝膠條件，適用于醫用可注射水凝膠領域[50, 53]。

圖3 溫度敏感性可注射水凝膠示意圖，Tgel代表最低臨界溶膠-凝膠轉變溫度[9]Fig.3 Schematic presentation of a thermo-gelling injectable hydrogel system, Tgel is the sol-gel transition temperature[9]

Tan等[54]通過將具有單個羧基的聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAM-COOH)利用酰胺鍵，接枝到胺化后的海藻酸酯(AAlg)上，合成了一種溫敏梳狀共聚物可注射水凝膠，在人體溫度下可發生溶膠-凝膠轉變。聚異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)是一種具有最低臨界溶膠-凝膠轉變溫度的典型溫敏材料。在低溫條件下，水凝膠中的親水基團幫助聚合物分子與水分子產生強相互作用，從而具有良好的溶解性；當溫度上升時，分子鏈上的正電荷靜電作用及化學反應活性增強，分子間氫鍵作用增強，從而脫去水分子而交聯形成三維凝膠網絡。此外，通過體外降解研究表明，基于海藻酸衍生物等對PNIPAM的修飾，該水凝膠表現出可降解性能。同時，體外細胞培養實驗也進一步表明該熱敏梳狀可注射水凝膠具有一定的生物相容性并能刺激細胞增殖。

利用pH變化實現凝膠化也是制備可注射水凝膠的重要方法。pH敏感性可注射水凝膠體系中通常含有高分子聚電解質，即聚合物鏈上有大量可以接受或釋放質子的可電離基團。當pH變化時，聚電解質中原本不帶電荷的酸堿度響應基團會發生電離而帶電，相同電荷產生的靜電排斥力將影響聚合物鏈間及其與水分子間的氫鍵作用，導致聚合物鏈的親疏水能力發生變化，從而發生溶膠-凝膠轉變[55]。

Zhao等[56]制備出一種以殼聚糖衍生物為基體的pH響應可注射納米復合水凝膠，有望用于骨組織再生的理想支架材料。他們將羧甲基殼聚糖(CMCh)和無定形磷酸鈣(ACP)進行復合，利用材料表面的可電離基團，通過調節體系的pH值，實現納米顆粒的靜電自組裝，從而完成凝膠化反應。在人體生理條件(pH=7.4)下，可形成穩定的固態水凝膠(圖4)。該研究制備出的CMCh-ACP水凝膠具有出色的生物相容性，有助于間充質干細胞的增殖和細胞黏附。成骨分化實驗證明，CMCh-ACP水凝膠還具有骨誘導作用，能提升體內骨組織形成的效率。因此，此種pH響應的CMCh-ACP可注射水凝膠有望被進一步開發為骨組織再生生物支架。

圖4 采用羧甲基殼聚糖(CMCh)和無定形磷酸鈣(ACP)制備的具有pH敏感性的CMCh-ACP可注射水凝膠：(a)在pH=7.0和pH=7.5條件下的樣品瓶傾倒實驗; (b)pH為7.5時，水凝膠在樣品瓶底部形成穩定凝膠；(c)CMCh-ACP水凝膠制備完成4和36 h后，通過注射器針頭的可注射能力[56]Fig.4 pH sensitive carboxymethyl chitosan-amorphous calcium phosphate(CMCh-ACP)hybrid gels：(a) Vial-inversion tests of CMCh-ACP hybrid gels at pH 7.0 and pH 7.5; (b) At pH 7.5, the gel remains at the bottom of the vial; (c) Injectability of CMCh-ACP gel (at pH 7.5) through medical syringes with needle after 4 and 36 h preparation[56]

3.2 基于化學交聯的可注射水凝膠

利用化學交聯方法形成可注射水凝膠，其交聯機理為利用化學聚合反應產生化學共價鍵，因而可形成更加穩定的共價交聯網絡。此類水凝膠中的聚合物分子鏈一般含有多種活性官能團，常見的交聯反應包括：席夫堿反應、邁克爾加成反應、點擊化學及光熱引發的交聯反應等[29, 48, 49]。

光聚合方法是制備化學交聯可注射水凝膠的重要方法。水凝膠的前驅體溶液在注射完成后，經可見光或紫外光的照射即可發生聚合[12]，從而在體內形成水凝膠，因此可以較好地控制凝膠化時間和位置。

Babo等[46]制備出一種基于透明質酸的可注射水凝膠，用于牙周缺損組織的修復。此種可注射體系基于甲基丙烯酸化的透明質酸(me-HA)，加入具有抗菌能力的血小板裂解液(PL)，在紫外照射條件下，利用光引發劑Irgacure 2959中的活性羥基即可完成光聚合反應，形成可注射水凝膠。經降解實驗可知，加入PL的透明質酸可注射水凝膠能夠增強水凝膠的結構穩定性，促進生長因子等活性物質的有效傳遞，從而有望增強牙周組織的修復和再生能力。

然而，需要光照條件的凝膠化方法會對實際操作造成一定的不便。因此，無需外界刺激的化學交聯方法引發了研究者的關注。席夫堿反應是利用羰基化合物與氨基化合物生成可逆亞胺鍵的化學縮合反應[57]。由于席夫堿反應條件溫和，且無需添加引發劑或交聯劑，因此被廣泛用于組織工程生物材料的研究。Qu等[58]利用動態席夫堿反應，制備出基于水溶性殼聚糖的自修復可注射水凝膠。研究者將CEC及苯甲醛修飾的聚乙二醇(PEGDA)溶液進行混合，CEC分子鏈上的氨基與PEGDA的苯甲醛基團可發生席夫堿反應，交聯形成水凝膠。當水凝膠受到巨大剪切力時，水凝膠中的可逆共價鍵因外力破壞而發生斷裂；當外力撤除后，動態席夫堿亞胺鍵可以再次形成，從而實現動態斷裂-重建的過程。因此，此種水凝膠可以順利通過注射器針頭。研究者利用大鼠體內注射實驗驗證了水凝膠的體內可注射性。隨后，還使用成纖維細胞L929細胞進行細胞毒性測試，結果表明此種可注射水凝膠具有良好的細胞相容性。

同席夫堿反應一樣，邁克爾加成反應也能夠在人體生理環境中進行，且反應時間可控[59]，因而成為另一種制備醫用可注射水凝膠的重要方法。Fiorica等[60]利用兩種透明質酸衍生物的原位聚合制備可注射水凝膠，該水凝膠有望用于關節軟骨損傷的治療。在這項工作中，研究者利用透明質酸的氨基衍生物(HA-EDA)及其α-彈性蛋白的接枝共聚物(HA-EDA-g-α-elastin)與二乙烯基砜衍生化的α，β-聚(N-2-羥乙基)-DL-天冬酰胺進行反應，原料中的氨基與乙烯基可在生理條件下發生邁克爾加成反應，制備出基于透明質酸的可注射水凝膠。該水凝膠展現出良好的溶脹性及可降解能力，同時與關節軟骨細胞具有良好的相容性，滿足了其作為可注射水凝膠支架以治療關節軟骨損傷的基本要求。

由于有效的化學鍵合與溫和的生物反應條件，酶促交聯和Diels-Alder(DA)點擊化學在水凝膠形成中的應用受到廣泛關注。Yu等[61]同時利用上述兩個交聯過程，成功地制備出可注射的透明質酸/PEG水凝膠。酶促交聯使HA/PEG在5 min內快速凝膠化，形成可注射的凝膠。DA反應交聯使得水凝膠具有優異的形狀記憶和抗疲勞性能。此外，包裹在水凝膠中的小鼠胚胎瘤細胞ATDC-5細胞表現出良好的代謝活力和增殖能力。綜合結果表明，結合兩個化學交聯過程形成的HA/PEG可注射水凝膠在軟骨組織工程中具有巨大的潛力。

4 可注射水凝膠的組織工程功能化發展

4.1 力學性能可媲美天然組織的可注射水凝膠

相比于合成高分子水凝膠，天然多糖基水凝膠具備更好的生物相容性，增強了組織工程應用中的安全性。然而，多數天然聚合物的力學強度較低，無法滿足軟骨組織等承力部位的使用要求，因而其使用范圍受到限制[12, 62]。針對水凝膠材料的增韌策略，Fu等[63]利用鈣離子交聯的海藻酸鹽網絡以及乙烯基改性熒光粉(YAG∶Ce-VTES)交聯的聚丙烯酰胺(PAAm)網絡，成功構建出分子鏈纏結、互穿的差異性雙網絡結構(double network，DN)，顯著提升了水凝膠的力學性能，此種海藻酸鹽/聚丙烯酰胺雙網絡水凝膠顯示出良好的延伸性和韌性，斷裂伸長率高達600%，壓縮強度高達3.6 MPa。針對組織工程生物材料，Fu等[64]提出，組織工程材料需具備足夠的強度及韌性，以匹配所修復組織的力學性能，從而獲得更加廣泛的應用。因此，制備力學性能可與天然組織相媲美的可注射水凝膠材料是組織工程移植物的重要挑戰。為制備多糖基高強度可注射水凝膠，You等[65]將季銨化纖維素與陽離子纖維素納米晶體相結合，制備出納米復合水凝膠材料，成功將水凝膠的力學性能提升了兩個數量級。體外毒性及動物體內測試表明該水凝膠具備良好的生物相容性。Pérez-Madrigal等[66]選用了兩種天然多糖基聚合物——透明質酸與海藻酸，制備出具有出色力學性能的可注射水凝膠。研究者首先將透明質酸進行巰基化修飾，并與炔基封端的聚乙二醇發生簡單高效的硫醇-炔點擊化學反應，形成水凝膠的第一層剛性網絡，之后繼續引入由物理交聯形成的鈣離子-海藻酸鹽，作為第二層柔性疏松網絡。該工作利用雙網絡結構的互穿及能量耗散機理[67]，成功制備出具有優異力學強度及足夠剛度的可注射水凝膠。由于存在雙重多糖基網絡，此種水凝膠具有良好的生物相容性，且機械強度具有長期穩定性，有較大潛力成為組織工程三維支架，以支持和促進骨組織的再生。Rodell等[68]將透明質酸進行功能化修飾，利用串聯超分子作用與化學共價鍵兩種交聯策略，制備了一種雙網絡水凝膠。他們以β-環糊精作為主體，金剛烷作為客體，利用酯化及酰胺化反應將主客體偶聯至透明質酸分子鏈，之后利用甲基丙烯酸鹽和二硫蘇糖醇的共價交聯形成雙層凝膠網絡。雙網絡結構大大提升了水凝膠的力學強度，主客體作用賦予水凝膠自修復及可注射性。經生物學實驗可知，細胞可在水凝膠內部維持兩周以上的代謝活性。此種天然多糖基雙網絡可注射水凝膠由于具有獨特的力學性能與生物相容性，在組織工程支架領域具有良好前景。

4.2 利用3D打印實現形狀定制

為克服傳統組織工程材料形狀與組織損傷處不匹配、立體結構內部區域難以調整等問題[69]，生物3D打印技術吸引了研究人員的關注。用于組織工程領域的3D打印技術以仿生為標準，根據預先設計的組織或器官結構數字化模型，將生物墨水材料經小口徑打印噴頭擠出，通過精準堆疊，制備出具有特定形狀的三維實體[70]。理想的生物打印墨水材料應滿足安全低毒、力學穩定等要求，且應具備合適的粘度，在打印過程中不會堵塞噴頭。另外，能夠負載細胞的生物墨水可幫助構建3D細胞培養環境，實現細胞培養所需材料的快速批量化生產，為細胞生長提供支撐作用，以促進組織形成，同時還可與缺損處結構相匹配(圖5)[71]。水凝膠材料具有大量親水基團及類似于細胞外基質的三維結構，其內部水合通道及交聯網絡可為細胞提供適宜的包覆條件。因此，具備剪切擠出能力的可注射水凝膠成為優選的生物3D打印墨水材料[72, 73]。相比于合成水凝膠，天然多糖基可注射水凝膠在力學強度與可控性方面尚有不足，然而具備了合成水凝膠難以比肩的生物相容性及生物可降解性，非常適合用作生物3D打印的墨水材料[74]。近年來，研究人員圍繞天然多糖基可注射水凝膠在生物打印中的應用展開了一系列研究[75, 76]。

圖5 3D打印仿生人耳[71]Fig.5 Image of the 3D printed bionic ear[71]

Müller等[77]以能夠促進有絲分裂的海藻酸鹽硫酸鹽水凝膠體系為基礎，引入具有良好打印能力的納米纖維素，通過兩種多糖材料的結合，成功制備出可進行3D打印的生物墨水。研究人員發現，細胞的生物性能與打印噴嘴的形狀密切相關，以最低的擠出壓力與剪切應力打印此種多糖基生物墨水時，可保持良好的細胞鋪展性。Heo等[78]利用海藻酸鈉與成骨多肽制備出一種可促進骨組織再生的新型3D打印生物墨水，體內和體外測試表明，這種生物墨水可為細胞增殖提供理想的穩定環境。為模擬生物組織的電生理環境，Shin等[75]利用微流體技術制備了透明質酸微凝膠，通過原位金屬還原提高了材料的電導率，并進一步將微凝膠組裝為含金屬-酚配位網絡的可注射粒狀水凝膠。此種粒狀水凝膠具備出色的可注射性及導電性，有望用于可穿戴電活性器件的3D打印及生物組織間電生理環境的構建。

組織工程植入物進入人體后，經常面臨新生血管數量不足而導致組織壞死的問題[22]。曾有研究者成功制備出可以控制生成因子傳遞的可注射水凝膠材料，以誘導血管的形成[79]。然而，新血管的生長仍需較長時間，因而限制了大型組織工程移植體的發展[80]。3D生物打印不僅可以制備組織工程支架材料，還可用于血管網絡結構的構建，以維持組織活性并促進組織功能的完善[81]。Kuss等[82]利用3D打印技術，在體外條件下實現了透明質酸基水凝膠中血管網絡的構建。研究者首先將脂肪間充質干細胞和臍靜脈內皮細胞植入經化學修飾的透明質酸-明膠復合水凝膠中，之后，通過3D打印制備出水凝膠/羥基磷灰石復合多孔支架。通過裸鼠皮下注射實驗可知，水凝膠系統促進了與裸鼠血管系統相匹配的心血管網絡的形成，證明了透明質酸基水凝膠在血管化生物打印中的巨大潛力。

5 結 語

隨著社會老齡化程度的加深及醫療技術的發展，組織工程技術愈發成為人體組織修復的重要手段。可注射性水凝膠可通過微創方式植入人體，能有效幫助病患減輕痛苦、減少手術風險，還能深入特定受損位置，填充不規則形狀，因而在組織修復及體內植入領域展現出巨大潛力。由于具備良好的生物相容性、生物降解性及結構可修飾性，多糖基可注射水凝膠在組織工程中的應用受到廣泛關注，并取得大量研究成果。

與此同時，多糖基可注射水凝膠在組織工程應用領域仍存在一些問題亟待解決：

(1) 實現天然組織的眾多功能是組織工程材料的重要目標。目前，單一組分的多糖類可注射水凝膠仍無法兼備天然組織在生物響應、生物力學、物質傳輸等眾多方面的完整功能，因而在實際應用中受到一定局限。近期，研究者嘗試利用蠶絲[83]等生物活性材料制備可注射水凝膠，為此領域拓展了新思路。新型生物活性材料的開發與利用，將有望推動可注射水凝膠的醫用功能性發展。

(2) 天然組織的功能機理研究尚有不足，從而難以確定并模仿功能實現的核心要素，這在根本上限制了醫用植入材料生物功能的發展。今后，多糖基可注射水凝膠的制備工作可與人體組織學研究相結合，從生物學原理出發，設計仿生材料結構與物化性質，以拓展其在組織工程中的臨床應用。