重組酶聚合酶擴增技術在植物病原快速檢測中的應用

馬文娣 田逸英 焦志遠 周濤 范在豐

摘要 ：植物病原的快速檢測對于植物病害防控具有重要意義。 重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）是近年建立的等溫核酸擴增技術，具有靈敏度高、特異性強、適用于現場快速檢測等特點，已在多個領域廣泛應用。本文對重組酶聚合酶擴增技術的原理、特性、檢測方法及其在植物病原體檢測領域的應用進展加以綜述。

關鍵詞 ：重組酶聚合酶擴增; 植物病原; 檢測

中圖分類號：

S 474

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020038

Recombinase polymerase amplification and its applications in

quick detection of plant pathogens

MA Wendi， TIAN Yiying， JIAO Zhiyuan， ZHOU Tao， FAN Zaifeng*

（Department of Plant Pathology， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract

The rapid diagnosis of plant pathogens is essential for efficient prevention and control of plant diseases. Recombinase polymerase amplification （RPA） is an isothermal nucleic acid amplification technology developed in recent years， which has been widely applied in many fields. It is suitable for on-site rapid detection with high sensitivity and strong specificity. In this paper， we review the principles， characteristics， detection methods of RPA and its applications in the detection of plant pathogens.

Key words

recombinase polymerase amplification; plant pathogen; detection

病原物的準確檢測和鑒定是植物病害防控策略中的關鍵環節。20世紀80年代以來，隨著聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）等分子生物學技術的迅速發展，核酸檢測技術憑借其快速、靈敏、特異性強的特點被廣泛應用于病原物檢測與鑒定領域。然而，傳統PCR對精密溫控設備的依賴性較高，需要PCR熱循環儀完成預變性、變性、退火及延伸等步驟，且反應耗時長，難以滿足經濟、高效的檢測需求。

近年來，等溫擴增技術逐漸發展成熟，與傳統PCR相比，其無需熱循環等步驟，反應溫度單一，擴增反應更為迅速;如環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術[1]，可以在較低的恒定溫度下完成核酸的快速擴增，具有檢測周期短、操作便捷、對精密溫控設備的依賴程度低等顯著優勢。

2006年，Piepenburg等建立了由多種酶和蛋白質參與的重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術[2]。RPA技術擴增速度快，特異性強，靈敏度高，對環境條件要求較低，將擴增體系與其他檢測技術結合，可以不再依賴精密的儀器設備，適用于病原物快速檢測及病害診斷，因此受到了廣泛關注。

1 RPA技術概述

1.1 反應原理

RPA技術是仿照T4噬菌體DNA的復制機制，在體外實現目的基因片段的恒溫擴增[2]。RPA擴增主要依賴于3種組分：來自T4噬菌體的重組酶uvsX及其裝載輔助因子uvsY[3]、單鏈DNA結合蛋白（gp32）以及來自枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis的鏈置換DNA聚合酶Ι大片段即Bsu DNA聚合酶。在25～43℃區間內的任一恒定溫度條件下，持續5～20 min即可完成核酸擴增反應[48]。

在ATP的作用下，能結合單鏈核苷酸的重組酶uvsX與寡核苷酸引物結合，形成蛋白寡核苷酸復合體。復合體通過雙向掃描雙鏈DNA，定位到與引物序列同源的靶序列;一旦定位到目標位點，重組酶可直接打開靶序列雙鏈DNA，并完成引物與同源序列的鏈置換反應形成D-loop結構[9]。單鏈結合蛋白與被引物置換的母鏈結合穩定其結構，防止置換的單鏈被替換，使模板雙鏈呈打開狀態。與此同時，蛋白寡核苷酸復合體主動水解反應體系中的ATP，使復合物構象改變，重組酶uvsX與引物解離，引物3′端暴露后迅速被鏈置換Bsu DNA聚合酶識別，啟動鏈的延伸，形成新的互補鏈。新合成的單鏈與原始互補鏈配對，最終形成一個完整的擴增子。新合成的擴增子作為模板，不斷循環重復擴增過程，實現核酸的指數級擴增。同時，體系中的輔助因子uvsY能夠促進uvsX與引物單鏈DNA的緊密結合，進而加快擴增反應[2]。若在反應體系中加入反轉錄酶首先進行反轉錄就可以檢測樣品中的RNA分子[7]。

1.2 引物設計

RPA引物的設計是重組酶聚合酶等溫擴增技術的核心。引物設計應基于特異性強的靶標序列[10]。RPA擴增的片段長度理論上可以達到1.5 kb， 但當目的基因片段長度在100～200 bp時，可以提高擴增的靈敏度和特異性，達到最佳擴增效果[2]。RPA引物最佳長度為30～35 nt。引物過長易產生二級結構，過短會降低擴增反應的重組率，影響擴增反應速率。單個引物應避免出現連續重復序列、回文序列及發卡結構。設計引物時，應避免引物之間互補形成二聚體。

1.3 RPA擴增產物檢測方法

1.3.1 凝膠電泳檢測

通常采用瓊脂糖凝膠電泳對RPA基礎反應體系的擴增產物進行檢測。RPA基礎反應體系相較于傳統PCR體系，添加了多種酶和蛋白質，為了避免反應體系中引物、酶等組分干擾凝膠電泳，出現拖尾現象，擴增產物需用酚氯仿純化后再進行瓊脂糖凝膠電泳[11]。經溴化乙錠染色后，紫外燈下（紫外線波長365 nm）進行檢測。

1.3.2 實時熒光定量檢測

實時熒光定量RPA（real-time RPA）是在RPA基礎反應體系中加入核酸外切酶Ⅲ（exonuclease Ⅲ，即exo）和特異性熒光標記的exo探針。exo探針包含一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，

分別結合在極為接近的胸腺嘧啶上（僅相隔1～5個核苷酸），兩熒光基團中間位置設計有一個四氫呋喃（THF）殘基。

在探針3′末端需要添加一個合適的阻隔基團，以阻斷鏈的延伸。當該結構保持完整時，體系內的熒光強度很低。當探針與目的序列結合時，THF位點被核酸外切酶Ⅲ識別并剪切，熒光報告基團與熒光淬滅基團分離，擴增產物與熒光信號同步積累，可以通過檢測熒光信號強度實時監測目的基因片段的擴增情況[2]。

1.3.3 側流層析試紙條檢測

側流層析試紙條RPA（lateral flow dipstick-RPA，LFD-RPA）方法原理[1]是帶有生物素修飾引物的核酸擴增產物可以和帶羧基熒光素（FAM）標記的特異探針雜交，使擴增產物同時攜帶FAM和生物素雙標記。該技術在RPA基礎反應體系的基礎上，加入核酸內切酶Ⅳ（endonuclease Ⅳ，即 nfo）、nfo探針和3′端帶有生物素標記的反向引物。nfo探針5′端帶有一個FAM熒光基團，3′端帶有一個阻隔基團，在中間位置帶有一個THF位點。僅當探針結合時，THF位點才能被核酸內切酶Ⅳ裂解，產生的3′端羥基是聚合酶結合的位點，啟動鏈的延伸，使5′端FAM標記和3′端生物素標記能夠整合到擴增產物中。

側流層析試紙條的前端有一條質控線，包被有固定抗體，質控線下端有一條檢測線，包被有生物素配體。為避免反應底物對試紙條上的抗體檢測形成干擾，通常將稀釋后的反應液滴加到試紙條上，檢測線上的生物素配體可以結合帶有生物素標記的擴增產物并顯色，擴增產物中的FAM標記可以與質控線包被的固定抗體結合呈現顏色，以確保試紙條的有效性。

2 RPA技術在植物病原檢測方面的應用

RPA作為一種新型核酸等溫擴增技術，自建立以來憑借高靈敏度、高特異性，操作簡單等優勢已經逐步應用于生命科學、食品安全、生物安全等領域。近年來，RPA技術已應用于植物病原物的快速檢測與鑒定。

2.1 RPA在菌物檢測方面的應用

在農業生產中，70%～80%的植物病害是由病原真菌侵染所導致的[12]。病原真菌侵害不僅會造成作物產量下降與品質降低，甚至會產生多種不同類型的真菌毒素和代謝物質，嚴重威脅食品安全與人畜的生命健康。卵菌包括多種疫霉、霜霉和腐霉，可侵染多種農作物造成毀滅性的病害。因此，應加強對植物真菌和卵菌病害的早期診斷與病原物檢測技術研究與應用。

油菜莖基潰瘍病是油菜上發生最為嚴重的真菌病害之一，其致病菌包括致病力較強，能夠產生西洛菌素PL（sirodesmin PL）的油菜莖基潰瘍病菌Leptosphaeria maculans以及致病力較弱、不產生毒素的油菜黑脛病菌L.biglobosa。Lei等[13]選擇ITS區域作為重組酶聚合酶擴增的靶標序列，篩選針對這兩種病原菌的特異性RPA引物和探針，利用便攜式實時熒光檢測儀實現了對甘藍型油菜莖基潰瘍病的兩種病原菌的快速檢測。本實驗室已建立了禾谷鐮孢Fusarium graminearum及藤倉鐮孢F.fujikuroi的RPA檢測體系（待發表）。

疫霉屬的植物病原菌可危害多種農作物和森林植物。Miles等[14]選擇疫霉屬卵菌線粒體基因組中高度保守的trnM-trnP-trnM區域，建立了疫霉屬基因組特異性分析的RPA方法;

根據其線粒體基因組atp9-nad9區域中具有的種間序列多態性

建立疫霉菌種間特異性分析的RPA方法。辣椒疫霉Phytophthora capsici是一種重要的病原菌，可侵染多種作物。Yu等[15]基于側流層析試紙條RPA法，依據Ypt1基因序列設計了特異性引物和探針，測定出最佳試驗條件為40℃，20 min，其檢出限為10 pg。Ammour等[16]針對馬鈴薯晚疫病菌的核糖體DNA ITS2 區域設計RPA引物和exo探針，建立了實時熒光定量RPA檢測體系。該反應體系在39℃反應30 min，每30 s檢測一次熒光強度，RPA檢測最低限可以達到50 fg/μL，同時該體系也可以檢測近緣種。

2.2 RPA在細菌檢測方面的應用

近年來，針對細菌性病害建立的RPA檢測體系也有報道，在特異性和靈敏性方面均達到了較好的檢測效果。

柑橘黃龍病Huanglongbing是一種嚴重的細菌性病害，影響著全世界的柑橘產業，并在全球造成數百萬的柑橘類植物死亡。Ghosh等[17]針對柑橘黃龍病病原菌Candidatus Liberibacter asiaticus保守的16S rRNA基因設計特異性引物對和探針，以純化的DNA和植物粗提取物為模板優化擴增溫度和反應時間，并結合側流層析試紙條檢測方法建立了簡便快速、靈敏的RPA檢測體系。

細菌性斑點病是在番茄上廣泛發生的重要病害。Strayer-Scherer等[18]選擇引起番茄細菌性斑點病的3種不同病原細菌Xanthomonas euvesicatoria、X.gardneri和X.perforans的特異基因hrcN建立了較為完善的實時熒光RPA檢測體系，可以實現對一種或多種植物病原細菌的有效鑒定與快速檢測。Wambua等[19]基于水稻植原體Candidatus Phytoplasma oryzae的imp基因，建立了適用于現場檢測的實時熒光檢測體系和側流層析試紙條檢測體系，實現對該病原體的特異性檢測。

2.3 RPA在植物病毒檢測方面的應用

植物病毒種類繁多，分布廣泛，危害嚴重[20]。因此，建立快速、高效的病毒檢測體系對于防控病毒病的發生與流行具有重要意義。

黃瓜綠斑駁花葉病毒Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）與玉米褪綠斑駁病毒Maize chlorotic mottle virus（MCMV）均為重要的檢疫性病毒。Jiao等[2122]基于CGMMV外殼蛋白（coat protein，CP）和MCMV CP基因的保守序列設計RPA的特異性引物，建立了反轉錄RPA（reverse transcription-RPA，RT-RPA）檢測體系，38℃條件下等溫反應30 min左右即可實現最佳擴增效果，比傳統反轉錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）檢測的靈敏度約高10倍，該方法已應用于檢測田間采集的樣品。

Kim等[23]基于蘋果莖溝病毒Apple stem grooving virus（ASGV） CP基因高度保守的區域設計特異性引物，擴增反應1～30 min，擴增產物量無顯著差異，說明反應1 min后，反應中的脫氧核苷三磷酸（dNTPs）或其他酶活性成分已消耗殆盡。該檢測方法具有較高的靈敏度和特異性，反應時間非常快。Babujee等[24]優化了RPA技術，可準確檢測馬鈴薯Y病毒Potato virus Y（PVY）的PVYO和PVYN株系。Babu等[25]基于熒光定量RT-RPA檢測方法，依據玫瑰叢簇病毒Rose rosette virus（RRV） 核蛋白N基因設計引物和探針建立的檢測體系具有高度特異性和靈敏性，最小檢測限度為1 fg/μL。此外，還建立了從不同的RRV侵染組織中快速提取病毒RNA的方法，與熒光定量RT-RPA方法結合可以用于玫瑰叢簇病毒的現場快速檢測。

Jiao等[26]基于CRISPR/Cas12a系統建立了多種蘋果病毒與類病毒（蘋果壞死花葉病毒Apple necrotic mosaic virus， 蘋果莖痘病毒Apple stem pitting virus， 蘋果莖溝病毒Apple stem grooving virus， 蘋果褪綠葉斑病毒Apple chlorotic leaf spot virus和蘋果銹果類病毒Apple scar skin viroid）的多重核酸檢測體系，該體系采用RT-RPA技術直接從粗提取物中檢測目標病毒，通過寡聚核苷酸結合的納米金顆粒，可肉眼區分出陽性結果，且該結果與傳統PCR檢測結果完全一致，特異性強。這種基于CRISPR/Cas12a的方法用時短，從采集樣品開始至多需要1 h即可完成檢測，不需要將樣品送到專門的實驗室即可實現多種病原物的現場檢測，便于及時采取防控措施。

Srivastava等[27]基于黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus（CMV）外殼蛋白基因保守區域，設計用于熒光定量RT-RPA檢測的特異性引物對和探針，分別使用紫外線探照器和熒光計直接觀察擴增反應產生的熒光信號，驗證出便攜式檢測的熒光定量RT-RPA方法的靈敏度僅略低于RT-RPA，但均高于常規RT-PCR的靈敏度。水稻黑條矮縮病毒Rice black-streaked dwarf virus（RBSDV）主要侵染水稻、玉米和小麥，可導致水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病，造成嚴重經濟損失。Zhao等[28]針對RBSDV病毒的P10外殼蛋白基因，利用RPA擴增結合瓊脂糖凝膠電泳檢測、實時熒光檢測、側流層析試紙條等多種擴增產物檢測方法，建立了簡便迅速、高效的水稻黑條矮縮病毒檢測體系。本實驗室已建立了南方水稻黑條矮縮病毒Southern rice black-streaked dwarf virus（SRBSDV）的RPA檢測體系（待發表）。

3 總結與展望

隨著分子生物學的不斷發展成熟，等溫核酸擴增作為PCR的重要分支，因其對加熱條件的要求較低，核酸復制速度快，操作簡便等技術特點而得到廣泛應用[29]。相比環介導等溫擴增（LAMP）[1]，滾環擴增（rolling-circle amplification）[30]，信號介導的RNA擴增技術（signal-mediated amplification of RNA technology）[31]，多重鏈置換擴增（multiple displacement amplification）[32]，RPA技術是相對較新的等溫擴增技術，憑借其更為簡單的引物設計、簡潔的擴增方案、反應速度更快，靈敏度高和特異性強的獨特優勢，不僅在植物病害檢測領域得到了普遍應用，在生命科學的其他領域也表現出巨大的潛力[7， 3340]，成為近年來廣受關注且發展最快的方法之一。

RPA技術目前還存在一些不足之處。例如，所需引物和探針較長（不適用于短序列擴增），缺少專門用于RPA引物和探針設計的軟件或網站，以及檢測成本較高等。然而，憑借其恒定溫度、擴增用時短及操作便捷等優勢，RPA技術在生物安全和醫學臨床等領域的現場檢測方面仍具有明顯的優勢和廣闊的應用前景。

隨著RPA技術的不斷完善，其應用范圍將會逐步擴大。首先，RPA基礎反應體系中的基本成分重組酶聚合酶是恒溫擴增反應的關鍵酶，通過對該組分的進一步探究，找到價格較低的替代品，可以降低RPA檢測成本。其次，通過對基礎反應體系進行優化，進一步拓寬反應的溫度范圍，使RPA擺脫加熱設備的限制，實現在自然溫度下的快速檢測。此外，將RPA方法與簡易的核酸提取方法、可視化產物檢測方法相結合，有望實現樣品處理、快速擴增及可視化產物觀測一體化的實時現場檢測。通過結合生物傳感器、芯片技術等技術手段，可以實現對常見病原的多重檢測，顯著提高檢測效率，滿足實際應用需求。另外，通過研發便攜式、智能化的RPA快速檢測裝置，將為在野外或基礎設施薄弱的地區實現一體化現場檢測提供便利。因此，RPA可作為PCR的輔助手段應用于生物學各領域的核酸分子檢測。隨著RPA技術的不斷發展與完善，在未來將逐步實現操作簡捷、反應迅速的一體化實時現場檢測，為生物安全、植物保護等領域提供有力的技術工具。

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（責任編輯：楊明麗）