miR-449b表達對慢性乙型肝炎合并肝細胞癌患者預后的影響

梁伊樂 胡新俊△ 岳 峰 徐 蕓

1.河南科技大學第一附屬醫院感染科 (河南 洛陽，471000) 2.鄭州大學第一附屬醫院消化內科

miRNA是18～25個核苷酸組成的小RNA分子，通過摻入RNA誘導的沉默復合物充當基因表達的調節劑。摻入的miRNA與miRNA互補的mRNA序列結合后，使mRNA鏈切割，從而導致目標轉錄物降解，使基因沉默[1]。通過這種轉錄過程，miRNA可以影響基因表達，從而調節各種生物學過程，包括腫瘤發生、進展、侵襲和轉移[2]。已有研究證實，miRNA在肝癌發生和轉移的細胞過程中起作用[3]。雖然原發性肝細胞癌(HCC)的治療和診斷取得較大進步，但5年生存率仍較低[4]。了解miRNA在HCC中作用對尋找臨床標志物、治療靶點能提供有效幫助，既往研究已經證實miR-449b的表達與HCC轉移和進展有關[5]，但miR-449b的表達與慢性乙型肝炎(CHB)合并HCC患者預后關系尚不清楚，本研究對此進行觀察，為臨床早期預測預后提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2014年1月至2018年1月在河南科技大學第一附屬醫院治療的100例CHB合并HCC患者為觀察組，選取同期40例CHB患者作為對照組。觀察組男52例，女48例；年齡37～78歲，平均(54.5±6.4)歲，乙型肝炎家族史17例，病毒載量(25.6±7.8)IU/ml，HBeAg陽性29例。對照組男21例，女19例；年齡36～79歲，平均(54.9±6.5)歲，乙型肝炎家族史9例，病毒載量(26.3±7.9)IU/ml，HBeAg陽性13例。兩組患者年齡、HBeAg陽性、性別、乙型肝炎家族史、病毒載量差異無統計學意義(P>0.05)，該研究符合我院倫理委員會要求。

1.2 納入排除標準 納入標準：①經病理學和影像學資料確診為HCC；②年齡>18歲；③資料完整；④簽署研究同意書；⑤均為慢性HBV感染；⑥既往無接受其他癌癥相關治療。排除標準：①合并其他惡性腫瘤、嚴重心腦內科疾病、復發轉移性肝細胞癌、精神疾病、免疫性肝病、丙型肝炎、酒精性及非酒精性肝病、腫瘤家族史、血吸蟲病性肝病；②正在參與其他研究；③預期生存時間較短(<3個月)。

1.3 檢測方法

1.3.1 患者外周血miR-449b檢測 將采集肘靜脈血約5 ml，置入分離膠真空管中，3 500 r/min離心10～15 min，取上清液，采用miRNA分離試劑盒(北京百奧萊博生物科技有限公司)分離外周血miRNA。用NanoDrop1000分光光度計對RNA濃度及純度進行測量，A260/A280為1.8～2.0為合格。使用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)對兩組患者外周血中miR-449b水平進行檢測。根據miScrptⅡreverse transcription kit(德國Qiagen公司)說明書進行逆轉錄，miR-449b引物及內參U6引物由上海生工生物合成。PCR反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共45個循環。miR-449b表達用2-△△CT法計算。

1.3.2 患者外周血HBV DNA病毒載量檢測 用Roche COBAS Taqman試劑盒檢測外周血中HBV DNA病毒載量，檢測下限為20 IU/ml。高病毒載量為>20 IU/ml。

1.4 患者隨訪方法 自患者入院開始對CHB合并HCC患者進行隨訪，包括上門、查找病例、電話及門診隨訪等方式，每3個月1次，隨訪終點為死亡，截止時間為2020年1月，觀察總生存期(OS)，即截止時間或死亡時間減去入院時間。

2 結果

2.1 兩組患者外周血miR-449b表達 合并HCC組外周血miR-449b表達水平為(0.27±0.10)，低于對照組(0.64±0.10)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 miR-449b表達與病毒載量及臨床病理資料關系 以外周血miR-449b表達量中位數0.40將患者分為兩組：miR-449b表達增高組(≥0.40，50例)、miR-449b表達降低組(<0.40，50例)。miR-449b表達與病毒載量、TNM分期、Chid-Pugh分級具有相關性(P<0.05)。見表1。

表1 患者臨床資料在miR-449b不同表達組的組間比較 [例(%)]

2.3 患者外周血miR-449b表達量與OS關系分析 觀察組共91例獲得隨訪，9例失訪，成功隨訪率91.0%，隨訪時間24～72個月，平均(49.9±7.9)個月，中位隨訪時間為50個月，患者死亡51例。miR-449b表達增高組2年死亡率為15.91%(7/44)，miR-449b表達降低組2年死亡率為38.30%(18/47)，組間差異有統計學意義(χ2=5.717，P=0.017)。Kaplan-Meier聯合Log-rank檢驗提示，miR-449b表達降低組OS短于miR-449b表達升高組(P<0.05)，見圖1。年齡、Chid-Pugh分級、TNM分期、病毒載量與OS具有相關性(P<0.05)，見表2。Cox分析結果顯示，miR-449b表達、年齡、TNM分期、病毒載量是CHB合并HCC OS的獨立影響因素(P<0.05)，見表3。

圖1 miR-449b表達升高和降低患者的OS曲線

表2 CHB合并HCC患者OS的單因素分析

表3 HCC患者OS的多因素分析

3 討論

HCC是世界范圍內較為常見的惡性腫瘤，具有發病率高、發病年輕化、進展快、治療敏感性低、生存期短等特點，尤其是CHB合并HCC預后更差，治療難度更高[6，7]。雖然HCC診斷及治療水平提高，但仍缺乏有效治療靶點及預后標志物。目前研究已經證實多種miRNA與HCC發生及進展有關，miR-449b表達下調與腫瘤不良預后相關，但在CHB合并HCC預后中尚未見報道[8，9]。

miR-449b下調被證實與鼻咽癌、非小細胞肺癌等較差預后顯著相關，miR449b可能具有抑制腫瘤的作用[10，11]。研究顯示，miR-449b在肝癌中具有靶基因特征，可通過抑制癌基因SOX4表達，從而抑制肝癌細胞死亡和遷移[5]；也可靶向β-catenin和Wnt信號傳導，從而抑制肝母細胞瘤生長[12，13]。

本研究顯示，CHB合并HCC患者外周血miR-449b表達下調，與既往研究結果相符[14]。miR-449b表達增高組患者2年死亡率顯著低于miR-449b表達降低組，且OS顯著高于后者，提示miR-449b表達降低的CHB合并HCC患者死亡率高，預后差。本研究表明miR-449b表達與病毒載量、TNM分期、Child-Pugh分級具有相關性，miR-449b表達升高患者病毒載量低、TNM分期低、Child-Pugh分級A級的比例更高，提示miR-449b可能通過降低腫瘤分期抑制腫瘤進展，但機制尚不明確。本研究顯示，外周血中miR-449b表達下調是CHB合并HCCOS的獨立危險因素，提示臨床可通過早期檢測外周血中miR-449b來早期判斷預后，從而指導臨床治療。本研究還表明病毒載量是CHB合并HCC預后的影響因素，與既往研究結果相符[15]。