基于PTEN/AKT通路變化探討脾虛內(nèi)環(huán)境與肝癌干性的關(guān)系*

陳 燕 吳英姿 羅紹駒 胡 浩 莫灼錨 張?jiān)娷姟?/p>

1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院中醫(yī)科 (廣東 廣州，510630) 2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科

隨著社會(huì)壓力的增加和生活節(jié)奏的加快，越來(lái)越多的人表現(xiàn)出脾虛相關(guān)癥狀，而研究發(fā)現(xiàn)脾虛導(dǎo)致的內(nèi)環(huán)境變化可能為腫瘤生長(zhǎng)提供有利的土壤，正如《衛(wèi)生寶鑒》所云“凡人脾胃虛弱，飲食不節(jié)或生冷過(guò)度，不能克化，致積聚結(jié)塊”[1]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，脾虛內(nèi)環(huán)境中有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽(Oatp)2b1的分布及功能發(fā)生改變，此變化是脾虛濕濁轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，且與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2-4]。腫瘤干細(xì)胞(CSCs)干性的表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤發(fā)病、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源，研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體受到內(nèi)環(huán)境影響產(chǎn)生不同的腫瘤微環(huán)境，可能引發(fā)CSCs相關(guān)信號(hào)通路和表面分子標(biāo)志物發(fā)生改變，其“干性”也可能隨之發(fā)生變化[5,6]，但脾虛內(nèi)環(huán)境變化對(duì)肝癌CSCs干性的影響鮮有報(bào)道。本研究將觀察脾虛內(nèi)環(huán)境變化對(duì)CSCs干性及其相關(guān)信號(hào)通路PTEN/AKT的影響，進(jìn)一步探討脾虛內(nèi)環(huán)境與肝癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞 SPF級(jí)C57BL/6小鼠60只(體重18～22 g，5～6周齡，雄性)以及Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞株，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)[SYXK(粵)2013-0002]。所有小鼠飼養(yǎng)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理原則，并通過(guò)廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)倫理審查(No.13201711-20)。

1.2 試劑和儀器 利血平購(gòu)于Sigma公司。DMEM、Trypsin-EDTA、血清購(gòu)于Gibco公司。Transwell板和Matrigel膠購(gòu)于Corning公司。CCK8試劑盒購(gòu)于北京金式金生物科技有限公司。主要使用儀器如下：超凈工作臺(tái)(蘇靜集團(tuán)，SW-CJ-2FD)，生物安全柜(蘇靜集團(tuán)，BHC-1300IIA/B3)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，3111)，低溫冷凍離心機(jī)(Thermo，ST16R)，臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南滬康，TDZ5-WS)，顯微鏡(OLYMPUS，BX61)，顯微境成像系統(tǒng)(OLYMPUS，DP72)，研究級(jí)倒置顯微鏡(mshOt，MF51)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀，TGL-16)，熒光PCR儀(Bio-Rad，CFX96)。

1.3 動(dòng)物分組及脾虛模型建立 所有小鼠在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為A組(空白組)、B組(脾虛組)、C組(肝癌組)、D組(脾虛肝癌組)，每組15只。B組和D組小鼠給予0.1 mg/kg利血平皮下注射，A組和C組小鼠則皮下注射等量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d，根據(jù)脾虛積分表評(píng)分，脾虛模型成模率100%[7]。

1.4 磁珠分離法分選CD133+Hepa1-6細(xì)胞 將培養(yǎng)好的2×107個(gè)Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞加入300 μl磷酸緩沖液(PBS+0.5% BSA+2mmol/L EDTA)，加入100 μl FCR Block緩沖液，再加入100 μl CD133磁珠，輕輕混勻后在冰上孵化30 min，用磷酸緩沖液洗一遍。將柱子放在分離架上，用磷酸緩沖液濕潤(rùn)后，再加入樣品，然后用磷酸緩沖液洗柱子3次；再將柱子放入15 ml離心管，加入1 ml磷酸緩沖液，快速推入，離心后收集CD133+Hepa1-6細(xì)胞培養(yǎng)備用[8]。

1.5 脾虛肝癌模型建立 參照前期研究建立脾虛肝癌小鼠模型[9]。將C組和D組小鼠麻醉，碘伏消毒，沿左肋緣下方開(kāi)腹，切口控制1 cm左右，暴露肝臟左葉；以無(wú)菌微量進(jìn)樣器抽取分選好的小鼠肝癌細(xì)胞CD133+Hepa1-6細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107個(gè)/ml，緩慢注射入肝臟，20 μl/只，無(wú)菌棉簽壓迫30 s，關(guān)閉腹腔縫合。SPF環(huán)境常規(guī)飼養(yǎng)28 d后，麻醉動(dòng)物后頸椎脫臼處死，取肝組織和癌組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 肝癌組織CD133+細(xì)胞培養(yǎng) 將C組和D組新鮮的肝癌組織用1× Hank′s液洗滌后剪碎，加入4 ml 0.5% dispase酶4℃消化過(guò)夜，離心棄上清后再加入0.25%胰蛋白酶37℃消化15 min，離心過(guò)篩網(wǎng)，收集沉淀，用10% DMEM培養(yǎng)3 d傳代繼續(xù)培養(yǎng)。參照1.4方法分選CD133+肝癌細(xì)胞并培養(yǎng)。

1.7 CD133+肝癌細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn) CD133+肝癌細(xì)胞按1×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5% CO2條件培養(yǎng)24 h后進(jìn)行CCK8檢測(cè)，每孔加入10 μl CCK8試劑，37℃、5% CO2條件孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm處的吸光值OD。

1.8 CD133+肝癌細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠平鋪于小室24孔板上，室溫下孵育1 h，待膠凝固后出現(xiàn)白色層使用。Transwell板中的下室加入10% 胎牛血清DMEM培養(yǎng)液。將生長(zhǎng)為對(duì)數(shù)期的CD133+肝癌細(xì)胞胰酶消化后，無(wú)血清培養(yǎng)液清洗、重懸后，調(diào)為5×105個(gè)/ml濃度，在上室內(nèi)進(jìn)行接種，每孔中加入200 μl 細(xì)胞稀釋液(1×105個(gè)細(xì)胞)，37℃、5% CO2條件培養(yǎng)16 h后，顯微鏡下觀察拍照，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量。

1.9 肝臟和肝癌組織CD133、PTEN、AKT及Oatp2b1 mRNA水平檢測(cè) 采用熒光定量Real Time PCR方法檢測(cè)，基因庫(kù)查找目的基因mRNA序列，在CDS區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃ 15 min，98℃ 5 min，10℃。熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，然后95℃ 5 s、62℃ 30 s、72℃ 1 min，40循環(huán)，然后95℃ 15 s，55℃ 1 min，95℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重和腫瘤體積觀察 D組和C組由于腫瘤的生長(zhǎng)而體重較A、B組增大。與C組相比，D組小鼠的體重和腫瘤體積明顯增大(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 腫瘤體積和小鼠體重比較 (與C組比較，*P<0.01)

2.2 CD133+肝癌細(xì)胞體外增殖能力觀察 癌組織分離出CD133+細(xì)胞進(jìn)行體外增殖，3 d后D組CD133+肝癌細(xì)胞OD值明顯高于C組，說(shuō)明脾虛肝癌組小鼠癌組織分選出的CD133+肝癌細(xì)胞增殖更快(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 兩組CD133+肝癌細(xì)胞體外增殖能力比較(與C組比較，*P<0.05，**P<0.01)

2.3 CD133+肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力觀察 遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，小室內(nèi)D組小鼠CD133+肝癌細(xì)胞數(shù)明顯高于C組，即脾虛肝癌組CD133+肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯強(qiáng)于肝癌組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 兩組CD133+肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力比較(與C組比較，*P<0.05)

2.4 各組肝臟和癌組織中Oatp2b1、CD133、PTEN和AKT mRNA表達(dá)情況 與A組相比，Oatp2b1 mRNA在B組、C組和D組肝組織以及D組癌組織中表達(dá)升高(P<0.01)；與C組相比，D組肝組織中Oatp2b1 mRNA表達(dá)明顯降低，而癌組織中則表達(dá)明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)圖4。在癌組織中，與C組相比，D組CD133 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，PTEN mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，而AKT mRNA的表達(dá)也明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

圖4 Oatp2b1 mRNA在各組肝組織和癌組織中的比較(與A組比較，*P<0.01；與C組比較，#P<0.01)

圖5 CD133、PTEN和AKT mRNA在癌組織中的比較(與C組比較，*P<0.05，**P<0.01)

3 討論

肝癌的死亡率位居全球腫瘤第3位，目前通過(guò)早發(fā)現(xiàn)早治療，肝癌患者生存期顯著延長(zhǎng)，但腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肝癌患者死亡的重要原因，目前研究證實(shí)肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移后5年死亡率高達(dá)70%以上，迫切需要更加完善的理論認(rèn)識(shí)和治療手段[10]。研究表明機(jī)體內(nèi)環(huán)境變化與癌基因、抑癌基因、黏附因子、免疫調(diào)節(jié)等因素密切相關(guān)，除了受遺傳影響，大部分腫瘤是機(jī)體內(nèi)外環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生有利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的變化在腫瘤發(fā)病機(jī)制中起著極其重要的作用[11]。著名中醫(yī)腫瘤專(zhuān)家于爾辛提出“肝癌的本是脾虛”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，并證實(shí)以脾為主辨證治療，可以改善荷瘤機(jī)體整體狀況，形成不利于肝癌生長(zhǎng)的內(nèi)環(huán)境，通過(guò)改善“患癌的土壤”而預(yù)防轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)[12]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)脾虛小鼠Oatp2b1表達(dá)發(fā)生變化，且脾虛內(nèi)環(huán)境促進(jìn)小鼠肝癌的生長(zhǎng)，但其具體機(jī)制尚不明確。

本研究采用利血平皮下注射法構(gòu)建脾虛小鼠模型，小鼠出現(xiàn)精神疲倦、形體消瘦、食欲下降、大便稀溏等癥狀，說(shuō)明脾虛模型建模成功[7]。在脾虛基礎(chǔ)上，建立小鼠原位移植肝癌模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脾虛肝癌小鼠腫瘤體積明顯大于非脾虛肝癌小鼠，脾虛肝癌小鼠的體重也隨著腫瘤的增大而明顯增加，神疲、食欲下降等癥狀也較肝癌組明顯。由此可見(jiàn)脾虛內(nèi)環(huán)境有利于小鼠肝癌生長(zhǎng)和發(fā)展。

Oatp2b1是人和動(dòng)物體內(nèi)重要的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在有機(jī)陰離子的轉(zhuǎn)運(yùn)中起著重要作用，介導(dǎo)內(nèi)、外源物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)保持機(jī)體和細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡起重要作用，Oatp2b1功能失調(diào)，將引起“濕濁”的吸收、分布和排泄障礙而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[3]。我們前期研究Oatp2b1可能是脾虛濕濁內(nèi)環(huán)境下肝癌發(fā)生和發(fā)展的“因濕致瘀”的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，其在各組織中的表達(dá)異常導(dǎo)致濕邪不能正常外排瘀阻于肝，從而促進(jìn)肝癌發(fā)生和發(fā)展[2, 4]。在本研究中，脾虛狀態(tài)下濕濁轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，機(jī)體發(fā)生代償反應(yīng)，故脾虛小鼠肝組織Oatp2b1 mRNA的表達(dá)高于空白組。在肝癌造模成功后，脾虛肝癌組肝組織Oatp2b1 mRNA表達(dá)低于非脾虛肝癌小鼠肝組織，提示脾虛內(nèi)環(huán)境下肝組織Oatp2b1功能下調(diào)，機(jī)體內(nèi)濕濁等毒素排泄障礙。我們還觀察到肝癌組癌組織Oatp2b1 mRNA表達(dá)低于肝組織；而脾虛肝癌組癌組織中，Oatp2b1 mRNA表達(dá)則高于肝組織，且明顯高于非脾虛肝癌小鼠癌組織。此結(jié)果表明脾虛內(nèi)環(huán)境中，癌組織Oatp2b1 mRNA表達(dá)發(fā)生代償性反應(yīng)而升高，在非脾虛肝癌小鼠體內(nèi)則沒(méi)有出現(xiàn)該現(xiàn)象。以上結(jié)果提示機(jī)體脾虛內(nèi)環(huán)境中Oatp2b1發(fā)生了變化，這種變化可能是導(dǎo)致脾虛有利于肝癌發(fā)生的重要原因。

越來(lái)越多的研究證實(shí)，肝癌CSCs自我更新、分化和增殖是肝癌發(fā)生和惡化的根源[13]。CSCs隱藏在腫瘤中，不易被識(shí)別和清除，是通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)識(shí)別的，而CD133是肝癌CSCs的生物標(biāo)志物之一[14]。腫瘤微環(huán)境是CSCs生長(zhǎng)的“土壤”，微環(huán)境是受機(jī)體內(nèi)環(huán)境影響的，機(jī)體受到內(nèi)環(huán)境影響產(chǎn)生不同的腫瘤微環(huán)境，引發(fā)CSCs相關(guān)信號(hào)通路和表面分子標(biāo)志物改變，導(dǎo)致CSCs與非CSCs之間存在動(dòng)態(tài)的相互轉(zhuǎn)換，機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變可能導(dǎo)致CSCs的增加[15]。靖林林等[16]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制和能量代謝障礙在病機(jī)上以脾虛為主，腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了重新編程，是癌毒轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素，并賦予CSCs分化潛能和干性，CSCs是至虛之處的毒根深藏。本研究結(jié)果顯示，脾虛肝癌組癌組織CD133+肝癌細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力明顯高于肝癌組，提示脾虛內(nèi)環(huán)境變化促進(jìn)了肝癌CSCs干性能力的發(fā)揮。

研究證實(shí)CD133+肝癌細(xì)胞具有高度致瘤性，在肝癌的生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起重要作用，被認(rèn)為是難以從根源上清除肝癌細(xì)胞的重要原因[17]。我們對(duì)癌組織中的CD133 mRNA進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示脾虛肝癌小鼠癌組織CD133 mRNA表達(dá)明顯高于非脾虛肝癌小鼠，提示脾虛內(nèi)環(huán)境有利于CD133+肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

磷酸酶及第10號(hào)染色體缺失的張力蛋白同源區(qū)(PTEN)是機(jī)體內(nèi)一個(gè)重要的抑癌基因，在干細(xì)胞的自我更新、基因組的穩(wěn)定性方面起著重要作用，PTEN的異常表達(dá)與腫瘤侵襲和不良預(yù)后密切相關(guān)。AKT通路負(fù)責(zé)由磷脂酰肌醇-3羥基激酶始動(dòng)的生物信息的傳導(dǎo)，其活化可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和血管生成，促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移。PTEN通過(guò)下調(diào)磷脂酰肌醇依賴(lài)性激酶AKT的活化來(lái)實(shí)現(xiàn)其抑癌作用，PTEN/AKT信號(hào)通路失衡在維持CSCs的干性方面發(fā)揮重要作用[18]。本研究結(jié)果顯示，與肝癌組相比，脾虛肝癌組小鼠癌組織PTEN mRNA表達(dá)降低，而AKT mRNA表達(dá)則明顯升高，提示脾虛內(nèi)環(huán)境中抑癌基因PTEN表達(dá)被下調(diào)，PTEN/AKT信號(hào)通路失衡，導(dǎo)致AKT活化，此現(xiàn)象可能是脾虛內(nèi)環(huán)境中CD133+肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及其干性能力增強(qiáng)的原因之一。

綜上所述，本研究提示脾虛內(nèi)環(huán)境有利于肝癌發(fā)生和發(fā)展，可能與脾虛濕濁轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的內(nèi)環(huán)境中PTEN/AKT信號(hào)通路失衡促進(jìn)肝癌細(xì)胞干性能力發(fā)揮有關(guān)，脾虛內(nèi)環(huán)境可能是肝癌干細(xì)胞生長(zhǎng)的有利土壤。但仍需進(jìn)一步探討其他肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)情況，而脾虛內(nèi)環(huán)境變化Oatp2b1表達(dá)異常是否參與調(diào)控PTEN/AKT信號(hào)通路仍需進(jìn)一步研究。