L-02-hNTCP穩定表達細胞系的建立與鑒定*

李瑞明 賀昱霖 程 彬 魏志強 孟忠吉

十堰市太和醫院(湖北醫藥學院附屬醫院)生物醫學研究所 (湖北 十堰，442000)

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈全球分布，是導致慢性肝炎、肝硬化和肝細胞肝癌的重要原因之一[1，2]。HBV宿主范圍有限，組織嗜性狹窄，用于體外感染研究的原代人肝細胞來源困難，阻礙了對HBV完整生命周期特別是病毒感染早期過程的研究，因此有必要建立一種穩定支持HBV感染的細胞模型。本研究在肝細胞系L-02中穩定表達HBV感染功能性受體鈉離子牛磺膽酸轉運多肽(NTCP)，從而建立高表達hNTCP的L-02細胞系，并篩選HBV易感的克隆，為研究HBV入侵細胞的機制和抗病毒藥物篩選提供新的模型。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質粒、細菌和細胞細制備 質粒hNTCP又名SLC10A1(Genebank編號：NM_003049，產品編號：CH890269)購自維真生物，骨架質粒為維真生物pENTER載體，含嘌呤霉素抗性基因。hNTCP基因通過限制性內切酶AsiSI/MluI克隆至pENTER載體，同時在hNTCP基因C末端包含一個Flag標簽(圖1)。大腸桿菌DH5a感受態購自北京天根。人肝細胞系L-02為本室保存。復蘇后培養于含10% 滅活胎牛血清DMEM培養基。

圖1 hNTCP質粒結構示意圖

1.1.2 主要儀器和試劑 酶標儀(德國Eppendorf)，定量PCR儀(美國ABI stepone plus)；熒光顯微鏡(日本Olympus IX71)；Chamber Slides(美國Thermo Fisher Scientific)；胎牛血清、DMEM培養基、脂質體Lipofectamine3000、Trizol購自生命技術公司；FastQuant RT Kit(With gDNase)購自北京天根；質粒提取試劑盒、定量PCR試劑盒購自羅氏公司；HBsAg和HBeAg EILISA檢測試劑盒購自科美公司；Flag抗體DYKDDDDK Tag(D6W5B)Rabbit mAb 購自CST公司；HBcAg兔多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；嘌呤霉素購自青島生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 hNTCP編碼區長1 050 bp，使用NCBI Primer Blast在線設計hNTCP定量PCR引物，跨越第一個內含子，產物全長107 bp：NTCP-U TTGAGGCACTGGCCATCTTG，NTCP-D GTGGTCATCACAATGCTGAGGTT。使用ABI Primer Express設計HBV定量PCR引物及探針，擴增區域位于HBV polyA序列(nt1828-nt1922)：PGP_v1(nt1828-nt1847)CACCTCTGCCTAATCATCTC，BC1_v2(nt1922-nt1903)TTATACGGGTCAATGTCCAT，HBV_qPCR_probe1(nt1853-nt1881)CATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTG，5′標記6-FAM，3′標記BHQ1。全部引物由上海生工合成。

1.2.2 質粒轉染及耐藥克隆篩選 質粒轉染參照Lipofectamine 3000說明書進行。在24孔板中每孔接種1×105個L-02細胞，37℃培養過夜，轉染hNTCP真核表達質粒0.5 μg/孔，培養24 h后，換液，加入含0.5 μg/ml嘌呤霉素培養基繼續培養4 d，至對照組細胞全部死亡，繼續培養1周，顯微鏡下挑取全部耐藥克隆至96孔板繼續培養。

1.2.3 免疫熒光檢測hNTCP-flag表達及篩選高表達克隆 耐藥克隆在96孔板培養1周后，消化接種部分細胞至Chamber Slide，每孔鋪1×104個細胞，培養24 h后，參照標準免疫熒光檢測流程檢測Flag標簽。熒光顯微鏡下觀察陽性數目細胞數目及熒光強度，選取最佳克隆繼續培養。

1.2.4 hNTCP mRNA水平的定量檢測 參照Trizol說明書分離提取L-02-hNTCP細胞總RNA。參照FastQuant RT Kit(With gDNase)說明書合成cDNA，Realtime PCR檢測hNTCP水平，擴增參數：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸20 s，循環40次。

1.2.5 HBV病毒感染L-02-hNTCP細胞 參照文獻[3]制備HBV感染性顆粒并制備感染性培養基(5×108GEq/ml)。在24孔板中每孔接種1.5×105個細胞，培養24 h，加入感染性培養基，繼續培養24 h，PBS洗3遍后換普通培養基繼續培養，收集第3、5天培養上清用于HBV抗原ELISA檢測。第5天收集細胞抽提核衣殼相關HBV復制中間體，用于定量PCR檢測。

1.2.6 免疫熒光檢測HBcAg L-02-hNTCP細胞感染HBV 24 h后消化接種于Chamber Slide，培養24 h后按標準免疫熒光程序檢測HBcAg。

1.2.7 HBsAg和HBeAg的酶聯免疫吸附(ELISA)檢測 采用ELISA試劑盒檢測培養上清中的HBsAg和HBeAg水平，參照說明書進行檢測。

1.2.8 核衣殼相關HBV復制中間體的提取及定量檢測 核衣殼相關HBV復制中間體的提取參考文獻[4]。實時定量PCR擴增參數：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸20 s，循環40次。

2 結果

2.1 hNTCP穩定高表達細胞系L-02-hNTCP建立 hNTCP質粒轉染L-02細胞經過嘌呤霉素篩選最終獲得92個耐藥克隆，對這些耐藥克隆進一步檢測hNTCP-Flag表達水平，共篩出2個高表達克隆，取表達水平最高的細胞株命名為L-02-hNTCP。

2.2 L-02-hNTCP細胞系中hNTCP-Flag的表達水平 免疫熒光結果顯示，L-02-hNTCP細胞能被Flag抗體特異結合，所有細胞都呈綠色，且陽性區域主要集中于細胞膜。對照組L-02細胞全部為陰性。見圖2。

圖2 L-02-hNTCP細胞系中hNTCP-Flag的表達(200×)

2.3 共培養后的L-02-hNTCP細胞系中HBcAg表達水平 免疫熒光結果顯示，L-02-hNTCP細胞被HBcAb結合，呈現紅色熒光，對照組L-02細胞全部為陰性(圖3)。

圖3 HBV感染性培養基共培養后的L-02-hNTCP細胞系中HBcAg表達的免疫熒光檢測(200×)

2.4 L-02-hNTCP細胞hNTCP mRNA表達水平 Realtime RT-PCR相對定量結果顯示，相比于L-02細胞，L-02-NTCP細胞系中hNTCP 基因mRNA水平高出(1 205.45±199.49)倍。PCR產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳，在107 bp處L-02-hNTCP細胞有很亮的條帶，而L-02只有極弱的條帶(圖4)。

圖4 L-02-hNTCP細胞hNTCP mRNA水平(A.實時定量RT-PCR檢測hNTCP mRNA表達水平；B.PCR產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳)

2.5 HBV感染性培養基處理后L-02-hNTCP細胞上清中HBsAg和HBeAg水平 HBV感染性培養基處理后第3 d和第5 d，L-02-hNTCP細胞上清中檢測到高水平的HBsAg和HBeAg，而同樣經過HBV感染性培養基處理的L-02細胞上清僅在第3 d能檢測到微量HBeAg。

2.6 HBV感染性培養基處理后L-02-hNTCP細胞內可以檢測到高水平復制中間體 在24孔板中，ReaL-time PCR結果顯示，HBV感染性培養基共培養后的L-02-hNTCP細胞內HBV復制中間體拷貝數為(6.57±0.36)×106拷貝/孔。

圖5 HBV感染性培養基處理后L-02-hNTCP細胞上清中HBsAg和HBeAg水平

圖6 HBV感染性培養基處理后L-02-hNTCP細胞內HBV 復制中間體水平

3 討論

HBV宿主范圍狹窄，缺乏穩定易操作的動物感染模型和細胞感染模型。常用的HepG2和Huh7細胞系不能被HBV感染。人原代肝細胞(PHH)、HepaRG細胞以及樹鼩原代肝細胞(PTH)可以用于研究HBV感染早期階段。但是，PHH獲取困難，成本高，可用性有限。HepaRG需要長時間誘導分化且感染效率低下。人血清可與HBV顆粒競爭結合到PTH細胞膜降低實驗可信度[5-7]。2012年李文輝等[8]首次發現了HBV/HDV感染的功能性受體鈉離子牛磺膽酸轉運多肽(NTCP)，并證實穩定表達hNTCP的HepG2細胞系可以被HBV感染，這為研究HBV感染早期過程和探索新治療方法提供了一個便捷的途徑。

本研究選用了實驗室常用的L-02肝細胞系，轉染hNTCP真核表達質粒，經過嘌呤霉素初篩及免疫熒光進一步篩選獲得一株hNTCP高表達細胞系L-02-hNTCP。免疫熒光結果顯示hNTCP陽性較強區域主要位于細胞膜，這與預期結果一致，hNTCP主要分布于細胞膜；大約30%的細胞具有很強的熒光信號，表明可以進一步篩選得到更純的高表達hNTCP細胞系，以獲得對HBV的更高敏感性。經HBV感染性培養基處理后，L-02-hNTCP細胞內檢測到了HBcAg，表明病毒顆粒進入了細胞內；在培養基上清中檢測到HBsAg和HBeAg，說明HBV侵入L-02細胞后開始表達HBV相關抗原。但是與質粒轉染相比，HBsAg和HBeAg表達強度明顯偏低，可以參照文獻[9，10]在后續的實驗中用更高濃度的藥物篩選及DMSO誘導刺激細胞分化以獲取高敏感穩定表達的HBV感染細胞系；第5d在24孔板中培養L-02-hNTCP細胞中HBV復制中間體DNA拷貝數達到數量級106。

本研究構建的L-02-NTCP穩定表達細胞系能被HBV感染性顆粒感染，并且表達HBV相關抗原，細胞內能檢測到HBV DNA。在之前的研究中，我們建立了HBV臨床分離株的克隆方法，并成功克隆了7個野生型HBV克隆[11]，結合L-02-NTCP過表達細胞系將為進一步研究HBV早期生命周期，以及探索治療HBV感染新技術提供了一個很好的細胞模型。