IL-34在肝癌組織中的差異表達及其臨床意義*

謝 飛 王洪斌 張瀚文 郭偉紅 劉鵬年△

1.河北一洲腫瘤醫院檢驗科 (河北 涿州, 072750) 2.河北省涿州市醫院檢驗科

肝細胞癌(HCC)是指起源于肝細胞的一種常見惡性腫瘤[1]。在我國惡性腫瘤中，HCC的發病率位于第3位，病毒性肝炎是其主要的發病原因[2]。HCC的早期癥狀不明顯，一旦出現癥狀，大多數已屬晚期。HCC主要致死原因是腫瘤進展后出現浸潤和轉移等，而腫瘤間質中存在著炎癥和免疫的微環境，這種微環境會為腫瘤細胞的轉化、生長、增殖和浸潤等腫瘤的發生發展提供可能[3]。白細胞介素34(IL-34)是一種新型的細胞因子，其促進巨噬細胞的分化和增殖的原因在于IL-34與巨噬和單核細胞表面所存在的集落刺激因子受體(CSF-1R)結合[4，5]。本研究旨在探討IL-34在HCC中的差異表達，并分析其臨床意義，以期為臨床診斷治療HCC提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取2017年8月至2019年12月住院的HCC患者54例，肝良性腫瘤患者21例，其中HCC患者均經過肝切除后送病理檢查后確診。HCC患者中男性38例，女性16例；年齡34～69歲，平均(51.22±12.35)歲；肝良性腫瘤患者中男性14例，女性7例；年齡32～71歲，平均(52.73±14.79)歲。

1.2 標本收集 術前抽取空腹患者全血樣本6 ml，4℃下4 000 r/min離心10 min，收集血清，置于-80℃冰箱備用。術后采集患者手術切除的HCC組織、相應癌旁組織(采自癌旁1 cm外)以及良性腫瘤組織標本。將組織樣本快速存于液氮中，再轉移至-80℃冰箱待用。

1.3 實驗試劑及儀器 Trizol逆轉錄試劑盒和實時PCR試劑盒購于Invitrogen公司；Anti-IL-34兔抗人多克隆抗體和IL-34的ELISA試劑盒均由美國Abcam公司提供；PCR引物購自北京擎科公司；實時PCR儀和生化檢測儀均購自美國Thermo Fisher公司。

1.4 ELISA檢測血清中IL-34表達水平 將-80℃冰箱中保存的血清室溫下自然解凍，按照ELISA試劑盒說明書的步驟，使用雙抗體夾心ELISA法檢測血清細胞因子IL-34的水平。

1.5 實時PCR檢測IL-34 mRNA的表達水平 IL-34引物序列：反向5′-GCAGAAAACCCGTGACAGT-3′，正向5′-GGAATGAGCCTTTGGAGAT-3′。GAPDH引物序列：正向5′-TGTGTCCGTC-GTGGATCTGA-3′，反向5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′。按照試劑盒說明書，用Trizol提取樣品RNA，將RNA反轉錄為cDNA，然后進行PCR檢測，即向各管中加入含染料2×Ex TaqMix 12.5 μl，再加入10 μmol/L引物混合物0.75 l(即對應的cDNA各1 μl)，向管中補加雙蒸餾水，使總體積為25 μl，預留一管用作陰性對照(不加模板)。混勻后置于PCR儀中95℃ 5 min預變性，95℃ 15 s，65℃ 30 s，40個循環。測定PCR產物的濃度和純度，每個樣品設3個復孔。實驗結果按照2-△△Ct方法來分析，△△Ct=△Ct(IL-34)-△Ct(GAPDH)。

1.6 Western Blot檢測IL-34蛋白的表達水平 將-80℃冰箱中保存的組織樣本室溫下自然解凍后加入細胞裂解液制備成勻漿液，高速離心后取上清液和緩沖液混勻后待用；配制分離膠和積層膠，蛋白上樣后，電泳將蛋白轉置于硝酸纖維素膜上；加入Anti-IL-34兔抗人多克隆抗體進行孵育，孵育完成后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，洗膜后加入化學發光試劑進行顯影。表達水平使用組織蛋白表達量與內參(β-actin)表達量的比值來計算。

2 結果

2.1 HCC和良性腫瘤患者外周血清中IL-34的水平比較 檢測結果顯示HCC和良性腫瘤患者外周血清中IL-34的水平分別為(6.84±0.53)和(3.64±0.42)pg/ml，兩組差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 HCC組織、癌旁組織和良性腫瘤組織中IL-34 mRNA的表達水平比較 見表1。

表1 HCC組織、癌旁組織和良性腫瘤組織中IL-34 mRNA的表達水平比較

2.3 HCC組織、癌旁組織和良性腫瘤組織中IL-34蛋白的表達水平比較 Western Blot檢測結果顯示，IL-34蛋白在HCC組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)，良性腫瘤組織中IL-34基本不表達，見圖1。

圖1 HCC組織、癌旁組織和良性腫瘤組織中IL-34蛋白的表達水平 1：HCC組織；2：癌旁組織；3：良性腫瘤組織

3 討論

IL-34是一種新型的細胞因子，存在于人體中的大多數器官組織中[6,7]。IL-34可結合CSF-1R，從而被認為是單核細胞和巨噬細胞的有效激活劑。IL-34和CSF-1有許多共同的功能特性，兩者通過共同的受體介導單核吞噬細胞的生物學行為[8,9]。IL-34引起的巨噬細胞異常活化與許多疾病有關，參與了眾多的炎癥過程，如Chemel等[10]報道滑膜IL-34表達水平與滑膜炎嚴重程度呈正相關；IL-34在慢性丙型肝炎患者中表達明顯升高，經研究發現IL-34可以促進和激活相關巨噬細胞的分化，從而導致肝硬化的發生發展[11]。

本研究結果表明HCC患者血清細胞因子IL-34水平明顯升高，提示IL-34參與HCC的發生發展過程并起了一定作用。通過Western Blot檢測HCC患者HCC組織和癌旁組織，以及良性腫瘤患者肝組織中IL-34蛋白的表達，結果表明HCC患者HCC組織中IL-34的蛋白相對表達顯著高于相應的癌旁組織及良性腫瘤組織(P<0.05)，證實了IL-34在蛋白水平參與了HCC的病理過程。通過實時PCR檢測HCC組織和癌旁組織，以及良性腫瘤組織中IL-34 mRNA的表達，結果表明HCC組織中IL-34的表達顯著高于相應的癌旁組織及良性腫瘤組織(P<0.01)，證實了IL-34在基因水平也參與了HCC的病理過程。AKT和ERK1/2信號通路及IL-1β、IL-6 和TNF-γ等重要的細胞因子參與HCC相關病理過程，被認為是HCC治療的新靶點[12-14]。而IL-34與這些信號通路的關系密切，Zhou等[15]研究發現在成纖維細胞中，IL-34通過激活下游信號，例如MAPK、PI3K-Akt、JAK和NF-κB，上調IL-6、IL-8的表達。研究結果提示IL-34可能在HCC的發生和發展過程中是一個重要的角色，但是IL-34在HCC發生發展中的作用機制有待于進一步的探索。