血清3-磷酸甘油醛脫氫酶抗體水平在視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病中的變化及其臨床意義

張?chǎng)?，袁婧，魏一鳴，張起堯，郭文治，劉洪波

視神經(jīng)脊髓炎(NMO)是一種由體液免疫紊亂介導(dǎo)、細(xì)胞免疫廣泛參與的以視神經(jīng)和脊髓受累為主的CNS脫髓鞘疾病，通常表現(xiàn)為或同時(shí)或分開的視神經(jīng)炎和急性縱向廣泛的橫向脊髓炎(LETM)，在亞洲和非洲人中發(fā)病率較高[1-3]，復(fù)發(fā)率及致殘率較高，預(yù)后不良，多數(shù)患者會(huì)留有嚴(yán)重的視力損害和肢體功能障礙等后遺癥[4-5]。2015年NMO譜系疾病(NMOSD)的國際診斷標(biāo)準(zhǔn)被正式提出，血清水通道蛋白4(AQP4)抗體在診斷NMOSD中高度特異性，但在臨床工作中即使是最好的測(cè)試也只有不超過80%的敏感性，甚至在一些少數(shù)民族中敏感性更低[1,6]。

3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶，GAPDH基因作為管家基因在同種細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)量一般被認(rèn)為是恒定的，所以GAPDH蛋白常被人作為細(xì)胞質(zhì)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，近年來有學(xué)者對(duì)其作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參的作用提出質(zhì)疑，指出在各種刺激條件下GAPDH 的mRNA 水平和細(xì)胞內(nèi)的蛋白定位都會(huì)發(fā)生變化[4,7]，GAPDH反應(yīng)性抗體可作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生物標(biāo)志物[8-11]，但是GAPDH抗體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的具體作用仍不明確。本研究通過檢測(cè)NMOSD患者外周血中GAPDH反應(yīng)性抗體的水平，探討 GAPDH反應(yīng)性抗體與NMOSD分期、分型和臨床特點(diǎn)之間的關(guān)系,從分子免疫角度進(jìn)一步探討NMO的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，為NMO的診療工作提供依據(jù)，為探索新的免疫治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 (1)NMOSD組：選取2017年7月至2018年2月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的NMOSD患者(包括新發(fā)和復(fù)發(fā))。所有NMOSD患者均經(jīng)過2名以上神經(jīng)內(nèi)科專家的診斷，診斷均符合2015年NMOSD診斷標(biāo)準(zhǔn)國際共識(shí)，且需滿足入組標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)(見表1、表2)，共入組28例。分別采集急性期(起病2周內(nèi))和緩解期(起病30～60 d)患者清晨空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈血標(biāo)本。NMOSD急性期患者抽血前2周內(nèi)無免疫藥物應(yīng)用及糖皮質(zhì)激素治療史。(2)正常對(duì)照組：選取醫(yī)院同期健康體檢的健康志愿者14名。

表1 AQP4(+)和AQP4(-)的NMOSD診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷標(biāo)準(zhǔn)AQP4(+)AQP4(-)1檢測(cè)AQP4抗體(CBA法)11/2817/282核心臨床特征?11/1117/17 (1)急性視神經(jīng)炎6/1111/17 ①頭顱MRI正?；騼H有非特異性白質(zhì)病變2/60/11 ②視神經(jīng)MRI長T2信號(hào)或增強(qiáng)的T1信號(hào)>1/2視神經(jīng)長度,或病變累及視交叉4/611/11 (2)急性脊髓炎(MRI長脊髓病變≥3連續(xù)椎體節(jié)段)9/1113/17 (3)極后區(qū)綜合征2/113/17 (4)急性腦干綜合征5/114/17 (5)其他腦干綜合征0/111/17 (6)癥狀性發(fā)作性睡病、間腦綜合征,頭顱MRI有NMOSD型間腦病變0/111/17 (7)大腦綜合征伴有NMOSD型大腦病變0/111/173排除其他診斷11/1117/17 注:?AQP4-IgG陽性NMOSD診斷至少1項(xiàng)核心臨床特征;AQP4-IgG陰性的NMOSD診斷在1次或數(shù)次臨床發(fā)作中至少有2個(gè)核心臨床癥狀

表2 NMOSD患者入組標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)入組標(biāo)準(zhǔn)排除標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)1 2015年診斷標(biāo)準(zhǔn)多發(fā)性硬化(MS)、吉蘭-巴雷綜合征、Ⅰ型糖尿病等標(biāo)準(zhǔn)2 臨床復(fù)發(fā)定義:新出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征或原有癥狀加重,持續(xù)時(shí)間超過24h,在MRI上有對(duì)應(yīng)的新病灶,2次臨床發(fā)作必須間隔1個(gè)月以上妊娠期和哺乳期女性;伴有嚴(yán)重循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病的患者標(biāo)準(zhǔn)3 臨床緩解期:自上次復(fù)發(fā)時(shí)間超過1個(gè)月,且未出現(xiàn)新的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征或原有癥狀加重伴有惡性腫瘤的患者;伴有嚴(yán)重感染和精神疾病的患者

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑 人GAPDH抗體ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。采用WE scanmk-2全自動(dòng)酶免儀(芬蘭生產(chǎn)),微量加樣器，EP管，離心機(jī)，水浴鍋

1.2.2 患者神經(jīng)功能評(píng)價(jià) 根據(jù)進(jìn)行擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表(EDSS)來判斷神經(jīng)功能缺損程度。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)GAPDH抗體 采用ELISA法，GAPDH抗原包被于微孔板上，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的GAPDH抗體會(huì)與抗原結(jié)合，未結(jié)合物將被洗去。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體，與結(jié)合在抗原上的人GAPDH抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，多余的抗體會(huì)被洗去。徹底洗滌后加入底物TMB顯色，TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，顏色的深淺和樣品中的人GAPDH抗體水平呈正相關(guān)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)定吸光度(OD值)。人GAPDH抗體濃度與OD值之間呈正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中GAPDH抗體濃度。靈敏度20 pg/ml，板內(nèi)、板間變異系數(shù)分別<10%、<15%。

2 結(jié) 果

2.1 NMOSD組與正常對(duì)照組的人口學(xué)特征 (1)NMOSD 組患者共28例，其中男9例，年齡10～73歲，平均(37.00±6.43)歲；女19例，年齡18～74歲，平均(50.21±3.12)歲；急性期18例，平均年齡(41.94±15.89)歲；緩解期10例，平均年齡(53.20±15.86)歲。(2)正常對(duì)照組共14名，其中男4名，年齡25～58歲，平均(45.00±12.79)歲；女10名，年齡10～88歲,平均(41.87±21.31)歲。

2.2 NMOSD組和正常對(duì)照組中血清GAPDH抗體水平的比較 NMOSD 組中血清GAPDH抗體水平[(52.48±12.07)pg/ml]較正常對(duì)照組[(45.65±2.51)pg/ml]明顯升高(P<0.05)。

2.3 急性期組、緩解期組和正常對(duì)照組中血清GAPDH抗體水平的比較 GAPDH抗體水平在急性期組[(55.99±13.79)pg/ml]較緩解期組[(46.15±2.88)pg/ml]明顯升高(P<0.05)；急性期組較正常對(duì)照組(45.65±2.51)pg/ml]明顯升高(P<0.01)；緩解期組與正常對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 AQP4-IgG(+)組、AQP4-IgG(-)組和正常對(duì)照組血清GAPDH抗體水平的比較 血清GAPDH抗體水平在AQP4-IgG(+)組[(54.29±14.01)pg/ml]與AQP4-IgG(-)組[(49.67±8.05)pg/ml]比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AQP4-IgG(+)組較正常對(duì)照組[(45.65±2.51)pg/ml]比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AQP4-IgG(-)組較正常對(duì)照組相比，血清GAPDH抗體水平明顯升高(P<0.05)。

2.5 GAPDH抗體水平與年齡、性別和EDSS評(píng)分的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析顯示，NMOSD患者血清GAPDH抗體水平與年齡、性別和EDSS評(píng)分均無關(guān)(均P>0.05)。

3 討 論

近年來人們對(duì)GAPDH的分布和功能的研究越來越多，GAPDH是一種在能量產(chǎn)生過程中起關(guān)鍵作用的糖酵解酶，它是一種多功能蛋白，除了具有糖酵解功能外，還具有多種活性。GAPDH作為一種膜蛋白[12-13],具有內(nèi)吞作用[14]。在細(xì)胞質(zhì)中,參與能量產(chǎn)生、微管蛋白聚合成微管[15]、控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的合成[16];在細(xì)胞核中，它參與了細(xì)胞核tRNA的輸出、DNA復(fù)制和DNA修復(fù)[17]。有報(bào)道[18-19]稱抑制GAPDH的糖酵解活性是導(dǎo)致各種形式神經(jīng)元凋亡的一個(gè)重要原因，GAPDH抗體可能誘發(fā)了免疫過敏反應(yīng)，通過激活補(bǔ)體和巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)元和軸突退化?？贵w與GAPDH結(jié)合也可抑制維持神經(jīng)元完整性的酶，抑制神經(jīng)元的糖酵解酶的活性[20]。研究[8]表明GAPDH抗體可能干擾了神經(jīng)元之間的連接，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

很早就有研究[2,21-22]顯示,GAPDH可能作為一種特異性自身免疫性抗原，在MS的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用。GAPDH能促使MS患者CNS的B細(xì)胞克隆性擴(kuò)增[3]，MS患者CSF及病變組織的單鏈可變區(qū)基因片段(scFv)抗體均對(duì)GAPDH有免疫反應(yīng)。MS與NMO都是炎性脫髓鞘疾病，有研究[23]表明，NMOSD的外周補(bǔ)體活化明顯大于MS，提示NMOSD的外周血中體液免疫較MS明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，NMOSD患者血清GAPDH抗體水平顯著高于正常對(duì)照組，表明GAPDH抗體在NMOSD的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要的角色。最新研究[8]指出，GAPDH能夠與層粘連蛋白結(jié)合，層粘連蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的一個(gè)組成部分，層粘連蛋白作為細(xì)胞分化的粘附底物，在神經(jīng)可塑性中起著突出的作用。所以GAPDH在NMOSD的發(fā)病過程中發(fā)揮的作用可能為：GAPDH抗體干擾GAPDH與層粘連蛋白的結(jié)合，影響神經(jīng)元的延展，從而誘導(dǎo)突起退縮，引起軸突脫髓鞘，GAPDH抗體在阻斷分子與層粘連蛋白和與CNS中其他粘附和突觸分子的結(jié)合時(shí)，可能改變了神經(jīng)元的可塑性，并且GAPDH抗體導(dǎo)致神經(jīng)元生成ATP減少，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元變性死亡。另有數(shù)據(jù)[24-26]顯示，GAPDH抗體增加所致GAPDH蛋白聚集，可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，導(dǎo)致了病灶內(nèi)脊髓腫脹、軟化、廣泛的脫髓鞘，并有壞死、軸突損傷。

有研究[27]表明，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)伴神經(jīng)疾病的患者體內(nèi)的GAPDH抗體水平明顯高于SLE患者，SLE伴神經(jīng)疾病患者的CSF和血清中都存在GAPDH抗體，表明在外周產(chǎn)生的自身抗體通過了通透性改變的血-腦屏障進(jìn)入CNS，影響了神經(jīng)元的功能。NMOSD的活動(dòng)病灶內(nèi)可見血管周圍免疫復(fù)合物、補(bǔ)體沉積，所以推測(cè)GAPDH的自身免疫反應(yīng)可能是來自分子模擬。本研究發(fā)現(xiàn)，NMOSD急性期患者血清GAPDH抗體水平明顯高于緩解期和正常對(duì)照組，提示血清GAPDH抗體在NMOSD的急性期起主要作用，所以急性期患者外周血中升高的GAPDH抗體可能是通過受損的血-腦屏障，引起免疫復(fù)合物沉積在血管周圍，補(bǔ)體激活，B細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，血管壁逐漸透明樣變、增厚、纖維化，待血清GAPDH抗體水平逐漸降低，疾病進(jìn)入緩解期。緩解期血清GAPDH抗體水平與正常對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明血清GAPDH反應(yīng)性抗體主要在NMOSD的急性期發(fā)揮作用，并與NMOSD 的疾病活動(dòng)性相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，NMOSD患者外周血中GAPDH抗體的水平與EDSS評(píng)分無相關(guān)性。神經(jīng)系統(tǒng)的自身抗體改變神經(jīng)功能，可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)精神疾病，范圍從輕度認(rèn)知障礙到嚴(yán)重的情緒損害和精神神經(jīng)疾病，這取決于抗體的靶點(diǎn)位置和血-腦屏障的滲透區(qū)域[28-29]。外周血中GAPDH抗體通過特定受損區(qū)域的血-腦屏障進(jìn)入CNS，即會(huì)誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，病灶內(nèi)補(bǔ)體激活、B細(xì)胞活化增殖、各種炎癥因子浸潤，一系列反應(yīng)致炎性脫髓鞘疾病，推測(cè)疾病的嚴(yán)重程度可能與機(jī)體的免疫狀態(tài)有關(guān)，認(rèn)為GAPDH抗體只參與了疾病的發(fā)病過程，而在疾病的進(jìn)展過程中作用甚微。

本研究中，NMOSD患者中AQP4-IgG(-)組與AQP4-IgG(+)組GAPDH水平均有升高，但前者更明顯。推測(cè)AQP4-IgG(+)患者發(fā)病機(jī)制中，AQP4-IgG介導(dǎo)的神經(jīng)損傷占主導(dǎo)地位，而GAPDH抗體的產(chǎn)生是一些次要因素；而在AQP4-IgG(-)的患者發(fā)病過程中，GAPDH抗體可能作為一種軸突自身免疫性抗原而發(fā)揮作用。本研究中，病例的局限性也可能產(chǎn)生一些影響，具體AQP4-IgG(-)組較AQP4-IgG(+)組GAPDH抗體水平升高更明顯的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的探索。

有研究[30]稱，NMOSD患者首次發(fā)病見于各種年齡段，多見于青壯年女性，女性的發(fā)病率約為男性的10倍。但本研究中Spearman相關(guān)分析顯示，NMOSD患者血清GAPDH抗體水平與年齡、性別和EDSS評(píng)分均無關(guān)。考慮到本研究的樣本量較小，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究證實(shí)。

綜上所述，血清中的GAPDH抗體參與了NMOSD的發(fā)病過程，可反映疾病的活動(dòng)性，并且與臨床分期、AQP4抗體狀態(tài)相關(guān)，而與其年齡、性別和EDSS評(píng)分均無關(guān)，可能作為NMOSD的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究從新的角度研究了NMOSD的發(fā)病機(jī)制，也為AQP4-IgG(-)的患者提供了新的臨床診療依據(jù)，但仍有待于進(jìn)一步的深入研究。在此之前，可以考慮將血清中GAPDH反應(yīng)性抗體的測(cè)定作為臨床診斷和分期的一種輔助指標(biāo)。同時(shí)也可以開展針對(duì)抑制抗GAPDH免疫應(yīng)答的藥物的研究，以期找到更有效的辦法降低NMOSD的復(fù)發(fā)率及致殘率，提高NMOSD患者的生活質(zhì)量。