高粱種質資源出苗相關性狀與SSR標記的關聯(lián)分析

劉秀慧，鄒桂花，翟國偉，劉合芹，鄭學強，陳合云

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 作物與核技術利用研究所，浙江 杭州 310021)

高粱[Sorghumbicolor(L.) Moench]是人類栽培的最古老作物之一，同時也是較早受到人工選擇進化影響的作物之一。在全世界分布范圍廣，具有食用、釀酒、飼用、能源、青貯用等多種用途。由于栽培區(qū)的氣候、土瓖、栽培制度的不同，在長期的種植過程中，經(jīng)過自然和人工選擇，在農(nóng)藝性狀、生理生化特性等方面形成了豐富的變異類型[1]。高粱播種深淺對出苗速度和出苗率的影響十分明顯。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，高粱的播種深度一般為3～5 cm。過深(7 cm)或過淺(不覆土)，均能引起發(fā)芽勢的顯著降低[2]。播種深度通過不同因子的作用影響出苗。在播種至苗期遇到干旱，種子缺水是出苗率降低的主要原因。播種過深，覆土加厚，增加了幼苗穿出土層的厚度和出土阻力，并由于土壤氧氣不足，易造成種子活力喪失[1-2]。不同種質資源對播種深度的耐受度不同。耐深播種質資源的發(fā)掘利用可保證深播下種子發(fā)芽率，還可以通過增加作物深層土壤中根密度，增強抗旱和抗倒伏能力，提高干旱半干旱地區(qū)高粱產(chǎn)量[3-4]。

不同研究表明，玉米、水稻中胚軸的伸長可以提高深播條件下出苗率，中胚軸長度與出苗速度、出苗率相關[5-6]。與其他禾本科作物一樣，高粱胚軸可分為上胚軸、中胚軸和下胚軸，但高粱上胚軸極短，下胚軸不明顯[7]。在高粱種子萌發(fā)過程中，中胚軸伸長將胚芽送至土表，中胚軸與其出苗頂土能力有關。研究表明，高粱中胚軸的伸長能力是決定深播條件下出苗率的重要因素[8]。可見，高粱中胚軸的伸長能力與深播條件下出苗率密切相關，但與高粱中胚軸特性等出苗相關性狀的分子標記研究鮮見報道。關聯(lián)分析是以連鎖不平衡為基礎，將目標性狀與等位基因(位點)聯(lián)系起來的分析方法，曾在人類遺傳學中廣泛應用；近年來，在植物不同性狀遺傳定位中廣泛應用[9]。前人利用關聯(lián)分析對高粱的不同農(nóng)藝性狀以及抗病性進行了關聯(lián)分析[10-12]，但尚無中胚軸等出苗相關性狀的研究報道。本研究以110份不同地理來源的高粱種質資源為材料，調查其中胚軸長、百粒重、根長和胚芽鞘長，利用55對SSR標記進行關聯(lián)分析，旨在挖掘與中胚軸長等出苗相關性狀的SSR標記位點，為高粱耐深播的分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以110份高粱種質資源為供試材料，其中：80份為來自全國各地的國內資源，包括山西25份、遼寧21份、北京10份、內蒙古5份、河北5份、四川3份、山東2份、黑龍江1份、吉林1份、陜西1份、江蘇1份、安徽1份、浙江1份、貴州1份、廣西1份、香港1份；30份為國外資源，包括蘇丹1份、日本6份、美國23份。表1為詳細資料。

表1 參試高粱種質名稱及來源信息

1.2 百粒重、中胚軸長、根長與胚芽鞘長度的測定

使用千分位天平稱量100粒高粱種子質量，3次重復均值為百粒重。按照鄒桂花等[3]利用水培方法測定中胚軸長、根長與胚芽鞘長度。每個品種選擇飽滿，無破損的種子90粒，分成3等份，作為3次重復。各品種播好后，設置人工氣候室的溫度28 ℃，黑暗培養(yǎng)，讓其自然萌發(fā)出苗。一周后，取樣測定中胚軸長度，每個品種每個重復選擇10株。

1.3 DNA提取與SSR分子標記檢測

采用CTAB法[13]提取各高粱葉片總DNA。選取均勻分布在高粱全基因組的55對SSR引物對110份高粱種質資源進行PCR擴增，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測[14]。SSR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計SSR引物擴增條帶，有帶記為“1”，無帶記為“0”。根據(jù)不同軟件要求轉換原始數(shù)據(jù)。使用SPSS軟件進行表型的相關性分析，應用Popgene32軟件計算遺傳多樣性指數(shù)。使用Structure 2.2軟件[15]分析群體結構，采用混合模型和等位變異發(fā)生頻率非相關模型進行分析，亞群數(shù)設為2～8，不作數(shù)迭代和重復次數(shù)均設置為50 000。每個參數(shù)運行5次，以最大似然值K為標準選取最佳的亞群數(shù)。

使用Tassel 5.0軟件(http://www.maizegenetics.net/tassel/)進行關聯(lián)分析，以Structure2.2軟件[15]計算的后驗概率作為協(xié)變量，將等位基因頻率小于0.05的稀有等位基因作為缺失處理，采用廣義線性模型(generalized linear model,GLM)和混合線性模型(mixed linear model,MLM)模型分別計算。以Bonferroni多重校驗矯正之后的0.05值，即9.259×10-4(0.05/54)為閾值，認為P值小于閾值的SSR標記與表型的關聯(lián)性顯著。

2 結果與分析

2.1 高粱百粒重、中胚軸長、根長與胚芽鞘長度的相關性分析

由表2可以看出，高粱中胚軸長與根長呈顯著(P≤0.05)負相關，與胚芽鞘長均呈極顯著(P≤0.01)正相關。百粒重與根長、胚芽鞘長均呈極顯著(P≤0.01)正相關，胚芽鞘長與根長呈極顯著(P≤0.01)正相關。其中，百粒重和胚芽鞘長相關系數(shù)最高，為0.602。

表2 高粱4個出苗性狀間的相關性

2.2 高粱種質資源 SSR標記遺傳多樣性分析

利用54對均勻分布在高粱全基因組且多態(tài)性好的SSR引物對110份高粱種質資源進行遺傳多樣性分析(表3)發(fā)現(xiàn)，共檢測到339個等位基因，其中有效等位基因有144個，所占比例為42.55%；各位點的等位基因數(shù)介于2～14個，平均每個位點檢測到6.28個等位基因，有效等位基因數(shù)介于1.21～5.35，平均有效等位基因數(shù)為2.67個；Shannon’s 信息指數(shù)介于0.380 1～1.989 0，平均值為1.129 9。

表3 SSR引物在參試高粱材料中的多態(tài)性

SSR標記中sm02004多態(tài)性最好，其有效等位基因數(shù)為5.35個，Shannon’s 信息指數(shù)為1.989 0；sm06130的多態(tài)性最差，其有效等位基因數(shù)僅為1.21個，Shannon’s 信息指數(shù)也最低。綜上可知，110份高粱種質資源的遺傳差異較大。

2.3 高粱種質資源群體結構分析

由圖1可知，高粱種質資源亞群數(shù)為3時，ΔK達到最高值，參試的高粱種質資源分布于穩(wěn)定的類群中。將比例超過后驗概率大于或等于0.7的高粱種質主要分為3個亞群(圖2)。紅色區(qū)域為第一亞群，包括7份，來自遼寧及日本和蘇丹等地。綠色區(qū)域為第2亞群，包括42份種質，主要來源于山西、內蒙、河北、北京、遼寧等地；藍色區(qū)域為第3亞群，包括15份種質，主要來源于美國8份及北京2份、河北1份、浙江1份、遼寧2份、山西1份。其余46份全屬于混合亞群。

圖1 ΔK值隨亞群數(shù)的變化Fig.1 Change of ΔK value with the number of subgroups

圖2 一百一十份高粱種質資源的群體結構Fig.2 Population structure of 110 sorghum germplasm resources

2.4 四個出苗性狀的關聯(lián)分析

通過GLM模型定位發(fā)現(xiàn)，與中胚軸長顯著(P≤0.05)關聯(lián)的標記最多，共有9個，在2～9號染色體上均有分布，貢獻率介于11.18%～28.05%，位于4號染色體上的sm04028標記貢獻率最高，此外，sm08075、sm09061和sm05088貢獻率超過了20%。利用MLM模型僅檢測到1個顯著關聯(lián)的標記sm05088。與高粱胚芽鞘長顯著(P≤0.05)關聯(lián)的SSR位點有5個，位于1號、9號和10號染色體上，貢獻率范圍為11.22%～18.12%；與根長顯著關聯(lián)的標記僅1個，為sm10097，貢獻率為28.03%；與百粒重顯著(P≤0.05)關聯(lián)的SSR位點有2個，為sm09094和sm01113，這兩個標記與胚芽鞘長也顯著關聯(lián)，貢獻率分別為17.11%和12.15%。

對檢測到的與中胚軸長等4個性狀顯著關聯(lián)的標記進一步挖掘優(yōu)異等位基因，因為等位變異表型值為正數(shù)時才對各性狀有促進作用，因此將表4中表型效應為正值的等位變異標記整理，并列出攜帶該等位變異的5個最佳材料(表5)。由表5可知，與胚芽鞘長、百粒重、中胚軸長和根長關聯(lián)的優(yōu)異等位位點分別有5、2、9和1個。其中與中胚軸長關聯(lián)的優(yōu)異等位位點表型效應值介于4.17～9.12。CLUBHEAD-3、BATHURST SUMAC、EARLY FOLGER、253、平頂香這5份材料中胚軸較長且含有8個以上的優(yōu)異變異位點。

表4 四個出苗性狀的關聯(lián)標記

表5 與四個出苗性狀相關的優(yōu)異等位變異及載體材料

3 討論

分析種質資源的遺傳多樣性對育種材料創(chuàng)新和品種選育尤其重要，利用SSR標記分析高粱遺傳多樣性和群體結構的報道較多[16-20]。本研究選用的54對SSR標記Shannon’s 信息指數(shù)平均值為1.129 9，田承華等[21]選用的10對SSR標記Shannon’s 信息指數(shù)平均值為1.195 8，二者研究結果接近。本研究將110份高粱材料聚為三亞群，通過與材料來源比較來看，相同區(qū)域的資源并不能很好的聚在一起，這說明育種家對種質材料的選擇過程中，在不同方向上的選擇壓力使得相同來源的材料表現(xiàn)出較大的基因型差異。田承華等[21]、呂芃[22]也利用SSR標記將高粱種質資源分為三個亞群。而趙香娜等[20]將甜高粱種質資源分為了兩個亞群，倪先林等[18]將糯高粱種質資源也分為了兩個亞群，這可能是由于倪先林等[18]、趙香娜等[20]的研究僅針對糯或甜種質資源。

關聯(lián)分析是解析復雜性狀遺傳機制的重要方法，群體結構分析可減少群體分類對關聯(lián)分析中亞群的劃分的影響。采用GLM和MLM兩種模型檢測位點可提高結果準確性和穩(wěn)定性。本研究采用GLM檢測到的與高粱胚芽鞘長、百粒重、根長、中胚軸長顯著關聯(lián)的SSR位點分別有5、2、1、9個，采用MLM模型僅檢測到1個與中胚軸長顯著關聯(lián)的位點，這與本研究中采用的顯著性檢驗閾值較為嚴格有關。

本研究發(fā)現(xiàn)，百粒重和胚芽鞘長表型數(shù)據(jù)極顯著相關，相關系數(shù)為0.602，與百粒重顯著關聯(lián)的2個SSR位點也與胚芽鞘長顯著關聯(lián)，這與相關性分析結果相符合。本研究在多個染色體不同位置上檢測到了與中胚軸長顯著關聯(lián)的位點，說明中胚軸長由微效多基因控制的數(shù)量性狀。有研究表明，多個位點可與作物同一性狀相關聯(lián)，同一位點也可與作物多個性狀同時關聯(lián)[22]，本研究也證實了這一結果。本研究發(fā)現(xiàn)的與中胚軸長顯著關聯(lián)且表型效應值較高的sm02041-1、sm03023-1、sm03101-1、sm04028-1、sm05088-1、sm06130-1、sm07063-1、sm08075-1和sm09061-1優(yōu)異等位變異可在基因聚合分子育種中作為選擇標記，指導親本組合選配，用于長中胚軸后代材料的選擇。進一步挖掘出有較長中胚軸且聚合了8個及以上優(yōu)異等位變異的載體材料5份，可作為優(yōu)異資源用于耐深播品種的分子輔助育種。

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