蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei)SWP2基因的克隆、表達及其在蝦類病害檢測中的應(yīng)用

沈衛(wèi)鋒，郭 琦，劉 莉，牛寶龍，翁宏飚，樓 寶

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水生生物研究所，浙江 杭州 310021)

微孢子蟲(microsporidia)是一種單細(xì)胞的真核內(nèi)寄生蟲，廣泛寄生于蝦、甲殼類等動物。蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)是微孢子蟲的一種，屬于腸胞蟲科、腸胞蟲屬，最早于2009年在泰國養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)中發(fā)現(xiàn)，隨后在亞洲各國的凡納濱對蝦、脊尾白蝦和中國對蝦養(yǎng)殖區(qū)陸續(xù)有EHP檢出[1]。研究表明，EHP的感染途徑較廣，可通過污染的養(yǎng)殖水體和病蝦進行水平傳播，也可以通過受精卵和蝦苗進行垂直傳播[2]。EHP感染的對蝦初期沒有明顯癥狀，但隨著病程的發(fā)展體色、胃、腸均表現(xiàn)出明顯異常，體色發(fā)白、腸道吸收功能下降，嚴(yán)重的出現(xiàn)肝胰腺萎縮，個別蝦體還會出現(xiàn)白便癥狀。由于該病在早期難以發(fā)現(xiàn)，往往要養(yǎng)殖30～45 d以上才會表現(xiàn)出生長緩慢，不長個的現(xiàn)象，因此，極易造成飼料空耗，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟損失[3-4]。近幾年，EHP在全世界范圍內(nèi)傳播，中國、馬來西亞、越南、印度尼西亞、泰國已經(jīng)成為了重災(zāi)區(qū)，印度和墨西哥也有發(fā)現(xiàn)，極大地打擊了蝦農(nóng)的養(yǎng)殖積極性。

常用的EHP檢測方法包括：組織病理學(xué)觀察、電子顯微鏡觀察、PCR、原位雜交等[5-10]，其中PCR方法因其高特異性、高靈敏度的優(yōu)勢而被廣泛使用。目前，EHP的PCR檢測方法已有一定數(shù)量報道，且主要集中在以一個核糖體小亞基作為PCR的目的基因[7，10]。經(jīng)NCBI檢索，我們發(fā)現(xiàn)該擴增的目標(biāo)區(qū)域與其他微孢子蟲的核糖體序列具有較高同源性，因此，用這些方法進行EHP檢測容易造成非特異性擴增，從而增加假陽性率。

本研究通過電子克隆方法擴增到了EHP的一種孢壁蛋白基因(SWP2)，該基因目前在NCBI數(shù)據(jù)庫中還未登錄，同時也檢索不到與之匹配的其他物種核酸序列。因此，以該基因為擴增靶標(biāo)所設(shè)計引物的特異性強，與病原EHP之間存在明確的對應(yīng)關(guān)系，適合用來開展蝦類EHP感染的定性檢測。

1 材料與方法

1.1 供試蝦

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)檢測樣本由浙江海鹽紅寶石水產(chǎn)有限公司提供。

1.2 試劑和儀器

基因組提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit購于北京TIANGEN公司；PfuDNA聚合酶購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR反應(yīng)試劑購于上海翊圣生物科技有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司；NdeⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、pET15b載體、T4 DNA連接酶、Top10和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

超聲波細(xì)胞破碎儀，天津津立儀器設(shè)備科技發(fā)展有限公司；全溫度振蕩培養(yǎng)箱，常州銳品精密儀器有限公司；高速冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.3 試驗樣品的收集與DNA提取

取20只活蝦，解剖獲得每只蝦的肝胰腺，保存于-70 ℃。取其中一小塊肝胰腺組織均勻涂抹于潔凈的載玻片上，用蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察每個樣品中EHP的存在。通過顯微鏡觀察確定感染EHP的樣品，并取這些樣品剩余的肝胰腺組織，每個樣品10 mg，利用基因組DNA提取試劑盒提取DNA，提取方法參照試劑盒操作手冊。

1.4 基因的克隆與測序

以蝗蟲SWP2基因的蛋白序列(API85832.1)為模板，檢索NCBI的蛋白數(shù)據(jù)庫，檢索到了一條來源于EHP且有228個氨基酸的同源蛋白(OQS53873.1)，并根據(jù)該序列找到了EHP的全基因組數(shù)據(jù)；定位SWP2蛋白在EHP全基因組序列上的相應(yīng)位置，整理獲得SWP2基因cDNA序列，命名為EHP-SWP2。以EHP-SWP2為靶基因設(shè)計PCR引物SWP2-F與SWP2-R，以EHP陽性DNA為模板，進行PCR反應(yīng)及產(chǎn)物克隆測序，驗證通過電子克隆方法獲得的SWP2基因cDNA序列的正確性。

1.5 序列與系統(tǒng)進化分析

利用BLAST在線工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行序列相似性分析；利用DNAMAN 6.0軟件進行核苷酸和推定的氨基酸序列分析；利用ProtParam(http://www.pasy.org/tools/protparam.html)預(yù)測蛋白的相對分子質(zhì)量及等電點；利用CLUSTAL Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustal)進行氨基酸的多序列比對; 利用 MEGA 7.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining method)(bootstrap值為1 000次)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.6 EHPSWP2蛋白的表達與純化

1.6.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建 pET15b-EHPSWP2載體步驟如下：(1)將PCR產(chǎn)物和pET-15b載體進行雙酶切。雙酶切體系：NdeⅠ(10 U·μL-1)與XhoⅠ(10 U·μL-1)各1 mL，10×FD Buffer 5 μL，目的片段20 mL，ddH2O補足50 μL。(2)連接酶切產(chǎn)物： PCR雙酶切產(chǎn)物與pET15b載體雙酶切產(chǎn)物比例為 7∶1，T4 DNA連接酶(5 U·μL-1)1 μL，10×T4 DNA連接酶Buffer 2 μL，ddH2O補足20 μL。(3)檢測陽性克隆：挑取克隆，經(jīng)PCR與雙酶切驗證正確的質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗證。

1.6.2 蛋白表達與純化

將測序正確的 pET15b(+)-SWP2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，熱激后涂布抗生素平板過夜；挑取單克隆到含有抗生素的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，按1∶100的比例將菌液加至新的含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至D值0.6時，添加0.5 mmol·L-1IPTG，20 ℃條件下過夜培養(yǎng)進行大量表達。離心收集細(xì)胞菌體并破碎細(xì)胞，分別對上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測。取上清粗蛋白與平衡后的柱填料孵育1 h，上柱收集流出，用Binding buffer清洗平衡柱子；用Washing buffer清洗柱子，并收集流出，然后用Elution buffer洗脫，收集流出。對粗蛋白、洗雜流出、洗脫流出分別進行SDS-PAGE檢測和Western blot驗證。將純度較好的3組分透析到緩沖液中，PEG20000濃縮，0.22 μm濾膜過濾后分裝，-80 ℃保存。

1.7 單克隆抗體的篩選與制備

1.7.1 動物免疫與小鼠效價測定

表達純化獲得的SWP2蛋白采用常規(guī)免疫方法對BALB/c小鼠進行免疫。初免后每隔3周免疫一次，細(xì)胞融合前3 d將小鼠再沖擊免疫一次。使用間接ELISA方法檢測免疫小鼠血清的抗體效價，選取免疫效價檢測值最高的小鼠追加免疫一次。

1.7.2 細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞株的篩選

取效價最高且加強免疫的小鼠脾細(xì)胞，與提前復(fù)蘇備用的骨髓瘤細(xì)胞進行融合，加入用HAT的細(xì)胞培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，鋪入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。細(xì)胞融合后第7天，通過ELISA間接法對所有細(xì)胞孔進行初次篩選，對初篩呈陽性的各細(xì)胞孔進行擴大培養(yǎng)和克隆化。經(jīng)數(shù)次克隆化直至所有細(xì)胞孔檢測陽性率為100%時，即可確定已獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將陽性雜交瘤細(xì)胞擴大培養(yǎng)并凍存。

1.7.3 單克隆抗體的制備與純化

取6周齡健康雌性小鼠，腹腔注射(1～2)×106個陽性雜交瘤細(xì)胞，7～10 d后待小鼠腹腔明顯膨大后收集腹水，離心取上清液，并倒入純化柱。靜置，待beads全部沉淀后收集腹水流穿。重復(fù)上述操作，10倍柱體積的1×PBS沖洗純化柱，將洗脫液加入純化柱并封閉下端，待beads全部沉淀后流出液體，用1.5 mL離心管收集洗脫液，分光光度計測定濃度并檢測抗體效價。

1.8 SWP2基因在蝦病檢測中的應(yīng)用

1.8.1 PCR方法

將EHP-SWP2作為靶基因設(shè)計PCR引物SWP2-F/R，擴增目標(biāo)片段長度為568 bp，同時以EHP-18S作為靶基因設(shè)計引物18S-F/R，擴增目標(biāo)片段長度為801 bp(表1)。以確定攜帶EHP羅氏沼蝦DNA為模板，分別以SWP2-F/R和18S-F/R為引物對進行PCR擴增，反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix 10.0 μL，10 mmol·L-1引物各0.5 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，反應(yīng)完畢后進行瓊脂糖電泳分析。

1.8.2 Western blot方法

取約30 mg蝦的肝胰腺組織，于冰上邊加液氮邊將組織研磨成粉末狀，加蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，靜置于冰上30 min充分裂解，離心取上清液，BCA 法檢測蛋白質(zhì)濃度。取30 μg蛋白上清液，以10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離和濕法轉(zhuǎn)膜，再以5%脫脂牛奶室溫封閉60 min，加入單抗(1∶5 000稀釋)于4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜，加入羊抗鼠二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育40 min，再用TBST洗膜。用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影和定影，檢測SWP2蛋白的存在。其中0號為EHP陰性的羅氏沼蝦樣品，1～5號為EHP陽性的羅氏沼蝦樣品。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 SWP2基因cDNA序列分析

SWP2基因的cDNA全長1 019 bp，包含一個名為MICSWaP的微孢子蟲專屬的保守結(jié)構(gòu)域。開放閱讀框(ORF)為687 bp，編碼一個含有229個氨基酸殘基的蛋白，5′非編碼區(qū)(UTR)為120 bp，3′非編碼區(qū)(UTR)為179 bp。Protparam在線軟件預(yù)測ORF編碼蛋白的相對分子質(zhì)量為26.32 ku，等電點為5.21，是親水酸性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)(圖1)。以EHP陽性的羅氏沼蝦DNA為模板，SWP2-F/R為引物，PCR擴增獲得了長度為568 bp的片段，測序結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物序列與電子克隆獲得的EHP-SWP2 cDNA序列完全一致。

圖1 EHP-SWP2基因cDNA全長序列及其編碼蛋白氨基酸序列Fig.1 Complete nucleotide sequences and deduced amino acid sequences of the EHP-SWP2 gene

將EHPSWP2蛋白與同源性較高的其他微孢子蟲孢壁蛋白進行比較，并構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹(圖2)。其中，Enterocytozoonbieneusi是一種能引起人類腹瀉的微孢子蟲，Hepatosporaeriocheir是一種寄生于絨螯蟹的肝腸微孢子蟲，Vittaformacorneae是一種能引起人類眼睛疾病的微孢子蟲，Tubulinosemaratisbonensis是一種寄生于黑腹果蠅的微孢子蟲。系統(tǒng)進化樹顯示Enterocytozoonbieneusi與Hepatosporaeriocheir處于同一分支，它們與EHP具有較近的親緣關(guān)系，Tubulinosemaratisbonensis與EHP遺傳距離最遠(yuǎn)，表明親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于蝦肝腸微孢子蟲EHP-SWP2蛋白與其他微孢子蟲孢壁蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of EHP-SWP2 protein and SWP protein from other microsporidia based on amino acid sequences with neighbor-joining method

2.2 SWP2蛋白的原核表達

表達載體構(gòu)建過程中酶切電泳見圖3-A、B，其中圖3-A表示SWP2基因片段的PCR產(chǎn)物，圖3-B表示重組載體的單酶切產(chǎn)物，兩個片段大小與理論片段大小相一致，說明表達載體構(gòu)建成功。利用鎳瓊脂糖親和層析方法對SWP2蛋白進行分離純化，并用SDS-PAGE 蛋白電泳驗證蛋白相對分子質(zhì)量大小(圖3-D)。通過His-tag 標(biāo)簽抗體檢測表達的重組蛋白，結(jié)果顯示，重組His-SWP2 蛋白在28 ku處有一條明顯條帶，大小和重組蛋白預(yù)測一致(圖3-C)。

A，SWP2基因片段PCR產(chǎn)物；B，重組質(zhì)粒酶切；C，重組蛋白的Western驗證；D，SDS-PAGE 鑒定純化的His-SWP2重組蛋白。A，PCR fragment of SWP2 gens; B，Recombinant plasmid digestion; C，Western verification of recombinant protein; D，Verification of His-SWP2 protein with SDS-PAGE.圖3 EHP-SWP2基因克隆與重組表達Fig.3 Cloning and expression of EHP-SWP2 gene

2.3 單克隆抗體的獲得

共獲得3株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的單克隆細(xì)胞株，分別命名為2D11H7、3G3D4、3H3C8，經(jīng)純化后的抗體的效價和濃度檢測結(jié)果如表2，其中3H3C8菌株的效價最高，以此菌株制備高效的單克隆抗體為后續(xù)Western blot實驗使用。

表2 不同細(xì)胞株分泌的單克隆抗體的效價和濃度檢測結(jié)果

2.4 SWP2基因在羅氏沼蝦EHP感染檢測中的應(yīng)用

從海鹽紅寶石水產(chǎn)有限公司提供的羅氏沼蝦送檢樣品中隨機抽取20個，解剖獲得肝胰腺組織，用蘇木精-伊紅染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)其中的5個樣品有EHP感染。用這5個樣品剩余的肝胰腺組織提取DNA，分別用SWP2-F/R和18S-F/R引物對進行PCR擴增，電泳結(jié)果顯示：用SWP2-F/R引物對擴增后的1～5號樣品均在550 bp左右位置出現(xiàn)明顯條帶，而用18S-F/R引物對擴增后僅1號和4號樣品在800 bp左右位置出現(xiàn)明顯條帶(圖4)。

1～5號泳道，1-5號EHP陽性樣品用SWP2-F/R引物的擴增結(jié)果；7～11號泳道，1-5號EHP陽性樣品用18S-F/R引物的擴增結(jié)果；6號泳道為DL2000分子質(zhì)量標(biāo)記。Lane 1-5，PCR results to No. 1-5 positive samples with SWP2-F/R primer; Lane 7-11，PCR results to No. 1-5 positive samples with 18S-F/R primer; Lane 6，DNA marker (DL2000).圖4 兩種引物PCR檢測效果比較Fig.4 Comparison of PCR detection with two kinds of primers

對上述5個蝦的肝胰腺樣品提取蛋白進行Western blot方法驗證，蛋白雜交結(jié)果顯示：1～5號樣品均出現(xiàn)特異性條帶(陰性對照樣品無條帶)，說明1～5號樣品均感染了EHP(圖5)。

0號泳道，EHP陰性樣品的雜交結(jié)果；1～5號泳道，1～5號EHP陽性樣品的雜交結(jié)果。Lane 0，Negative sample with Western blot; Lane 1-5，Results to No. 1-5 positive samples with Western blot.圖5 Western blot檢測結(jié)果Fig.5 Results of Western blot analysis

3 討論

孢壁蛋白是微孢子蟲的一種結(jié)構(gòu)蛋白，它在不同真核生物中的同源性很低，目前僅有少數(shù)孢壁蛋白被鑒定出來，如：來源于Encephalitozoonintestinalis的SWP1、SWP2、EnP1[11-12]，來源于E.cuniculi的EcSWP1、SWP3、EcCDA、EnP1、EnP2[13-16]，來源于家蠶微孢子蟲(Nosemabombycis)的SWP7、SWP9、SWP26、SWP30、SWP32等[17-19]，來源于蝗蟲微孢子蟲的AlocSWP1、AlocSWP2等[20-21]。研究表明，微孢子蟲的孢壁蛋白在孢子形成、寄主細(xì)胞識別與侵染等過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過生物信息學(xué)方法從公布的EHP全基因組序列中克隆到了一個孢壁蛋白SWP2，該蛋白編碼229個氨基酸，預(yù)測分子量為26.32 ku，大腸埃希菌原核表達結(jié)果顯示SWP2實際大小與預(yù)測一致。

除了肝胰腺組織外，腸道是EHP感染蝦體的另一個重要組織，在養(yǎng)殖過程中，感染了EHP的蝦往往會出現(xiàn)“光吃飼料不長個”的病癥，這就是營養(yǎng)消化吸收障礙的典型癥狀。我們用EHP-SWP2蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源比對，發(fā)現(xiàn)SWP2蛋白與引起人類腸道頑固性腹瀉的畢氏腸孢蟲(E.bieneusi)的一個蛋白同源性高達52%，這或許從另一個側(cè)面說明了EHP感染與蝦類腸道疾病發(fā)生的相關(guān)性。

關(guān)于EHP的PCR檢測方法已有不少報道，但主要是以核糖體18S為靶基因。有研究人員設(shè)計了V1F/964R、510F/510R等不同引物對來檢測EHP的存在[6，22]，但用這些引物擴增得到的片段序列經(jīng)NCBI檢索，發(fā)現(xiàn)與其他微孢子蟲核糖體18S序列具有較高同源性，因此，這些片段很有可能來源于其他種屬的微孢子蟲，而并非是引起蝦肝腸微孢子蟲病的EHP。本研究以EHP-SWP2基因為靶標(biāo)，設(shè)計了特異性引物SWP2-F/R，并應(yīng)用在羅氏沼蝦EHP感染的檢測中，同時以18S-F/R引物作為對照。PCR結(jié)果顯示：5個確定的陽性樣品用SWP2-F/R引物均能得到正確條帶，而用18S-F/R引物只有2個樣品出現(xiàn)條帶，說明SWP2-F/R引物的檢測成功率明顯優(yōu)于18S-F/R引物。我們推測，由于核糖體18S基因在不同種屬微孢子蟲中具有較高保守性，一旦檢測樣品中除了EHP外存在其他種類微孢子蟲，就容易造成引物在退火配對過程中與其他微孢子蟲的18S基因形成非特異性結(jié)合，從而影響其與EHP-18S基因片段的結(jié)合能力。而SWP2-F/R引物針對SWP2基因，孢壁蛋白基因為了適應(yīng)不同寄主的生理特點進化出了更高的特異性，因此，比核糖體18S基因更適合于微孢子蟲種屬的鑒定。本研究還通過蛋白原核表達、單克隆抗體制備、Western blot雜交等一系列實驗，證明了SWP2蛋白與序列分析的預(yù)測結(jié)果一致，同時利用單克隆抗體進行蛋白雜交也可以作為蝦類EHP病害的一種檢測方法。

目前EHP的SWP1、SWP2基因已克隆，但是否還有其他孢壁蛋白基因的存在還需要挖掘。孢壁蛋白在寄主識別與侵染過程中起著關(guān)鍵作用，因此進一步研究該類蛋白的功能及與寄主的互作方式對于蝦肝腸微孢子蟲病的發(fā)生與防治具有重要指導(dǎo)意義。

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