茄子脂氧合酶家族基因全基因組鑒定與表達分析

趙國富，嚴亞琴，汪精磊，魏慶鎮，包崇來，*

(1.臺州科技職業學院 農業與生物工程學院，浙江 溫嶺318020； 2.浙江省農業科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)又名脂肪氧化酶，是一類重要的含非血紅素鐵的蛋白，能夠催化多不飽和脂肪酸氧合生成脂肪酸氫過氧化物，廣泛存在于植物、動物和真菌中，參與茉莉酸，以及醛類和醇類等芳香物質的生物合成[1-2]。LOX家族蛋白是一類進化上高度保守的蛋白質，其典型的特征是都含有一個N端由α-螺旋構成的酶催化中心保守結構域和C端由β-折疊而成的PLAT(polycystin-1，lipoxygenase，alpha-toxin)保守結構域[3]。根據LOX家族基因催化底物亞油酸或亞麻酸被氧化時不同的反應位置可將LOX家族基因分為9-LOX(C-atom 9)和13-LOX(C-atom 13)2個亞家族。其中，根據氨基酸序列的相似性和N端有無葉綠體運輸多肽可以將13-LOX亞家族基因分為Type I 13-LOX和Type Ⅱ 13-LOX[1]。LOX蛋白在植物各個組織器官中普遍存在，但是LOX家族基因的表達在植物不同組織器官、各個發育階段，以及對生物和非生物的逆境脅迫響應中表現出較大差異[4]，意味著LOX家族基因在調節植物生長和植物逆境響應方面具有重要的作用。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中鑒定到了6個候選LOX基因[5]，AtLOX1的表達水平在病原菌侵染和脫落酸、茉莉酸甲酯的誘導的情況下會發生變化[6]；AtLOX2參與調控茉莉酸酯前體的生物合成[7]；AtLOX3和AtLOX4是擬南芥育性和花朵發育所必需的[8]。在番茄(Solanumlycopersicum)中，RT-PCR分析表明，LOX家族基因TomloxA和TomloxB在番茄果實中表達[9-10]；TomloxC只在番茄成熟期表達，并且可以催化脂肪衍生的芳香物質的合成，從而影響番茄風味[11-12]。TomloxD在果實中表達量非常低，但在果實損傷處理后表達量顯著升高，被證實參與茉莉酸的生物合成，以及番茄對非生物和生物脅迫的耐受性[13]；TomloxE的表達則主要受機械損傷的誘導[12]。TomloxF基因編碼13-LOX類型蛋白，并受惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)BTP1刺激[14]。在黃瓜(CucumissativusL.)基因組中鑒定到了23個LOX候選基因，通過表達分析發現有12個CsLOX基因在果實發育過程中差異表達，并在不同逆境脅迫下和不同激素處理中也具有不同表達水平[15-16]。Wang等[17]在蘿卜(Raphanussativus)基因組中鑒定了11個LOX候選基因，比較蘿卜在不同逆境條件下RsLOX基因表達水平發現，在低溫處理下RsLOX7、RsLOX8和RsLOX9的基因表達水平均高于其他RsLOX基因；此外，RsLOX7和RsLOX8在鹽脅迫處理過程中的基因表達水平也高于其他RsLOX基因，推測RsLOX7和RsLOX8可能在蘿卜抗逆過程中發揮重要作用。所以，深入發掘不同植物的LOX基因信息和研究LOX基因的作用機制，有助于更好地了解植物器官發育和響應環境脅迫的機制，對作物品質和抗逆育種具有實際的應用價值。

茄子(SolanummelongenaL.)，別名矮瓜、落蘇，一年生草本植物，原產溫帶和亞熱帶。茄子適應性強，營養豐富，產量高，是我國廣泛栽培的主要蔬菜之一，具有重要經濟價值。茄子在生長過程中極易受極端天氣、病原菌等多種非生物和生物脅迫影響，造成經濟損失。深入研究茄子的抗逆機制對今后的茄子育種具有重要的意義。目前，茄子的三代基因組測序已完成[18]，為從基因組水平對LOX家族基因進行鑒定和分析打下了良好的基礎。本研究通過生物信息學手段對茄子的LOX家族基因進行鑒定和分類，同時利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)，分析LOX家族基因在茄子不同器官的表達情況，為進一步探索LOX家族基因在茄子生長發育的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 茄子LOX家族基因的鑒定

茄子全基因組數據庫來源于浙江紫紅線茄(杭茄類型)HQ-1315的基因組數據(http://eggplant-hq.cn/Eggplanthomeindex)。以Pfam數據庫(http://pfam.xfam.org)中LOX結構域(PF00305)為模型，利用HMMER軟件包中hmmsearch軟件對茄子全基因組數據進行Blast P(E-value=10-5)，篩選得到茄子SmeLOX家族基因的序列信息。利用python語言中的Biopython模塊(https://biopython.org/)對茄子12個SmeLOX蛋白的等電點(PI)、蛋白分子量(MW)、親水性、芳香性等理化性質進行預測[19]。

1.2 茄子LOX基因在染色體上的分布與系統發育樹構建

通過python編程處理茄子基因組數據，獲取12個SmeLOX基因在茄子染色體上的位置信息；使用MG2C軟件(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)繪制茄子LOX家族基因染色體分布圖。使用Clustal軟件將茄子LOX家族基因編碼的蛋白氨基酸序列與來自其他17個物種的123個LOX蛋白氨基酸序列[17]進行多序列比對，利用MEGA-X軟件，選擇鄰接法(neighbor-joining method，NJ)構建系統發育樹。參數設置如下：Bootstrap設置為500次，模型選擇JTT Matrix(Jones-Taylor-Thornton)，缺失值處理設置為partial deletion，閾值設置為70%。

1.3 基因結構與保守基序分析

使用MEME(Multiple EM for Motif Elicitation)交互式分析工具對茄子LOX家族基因編碼的蛋白結構域進行分析，Motif數量設為20，Motif長度設置為6～200。使用TBtools軟件[20]對茄子LOX家族基因結構進行分析，獲得茄子LOX家族基因結構和保守結構域的示意圖。使用EMBOSS工具(http://emboss.sourceforge.net/)比較序列之間的相似度。

1.4 表達模式分析

浙江紫紅線茄(HQ-1315)5個組織(根、莖、葉、花、果實)總RNA的提取參照天漠生物總RNA提取試劑盒的說明進行操作。提取后的RNA，使用德國ABM公司反轉錄試劑盒(5×All-In-One RT masterMix)按照說明書方法進行cDNA合成。使用ABI Step One Plus熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR，在熒光定量PCR儀專用96孔板中依次加入cDNA模板1 μL，10 μmol·L-1正向引物和10 μmol·L-1反向引物(表1)各0.4 μL，2×TranStart?Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，ddH2O 8.2 μL。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，40個循環。熒光定量PCR結束后，以18SRNA為內參基因，使用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量[21]。

表1 本研究使用的qRT-PCR引物

2 結果與分析

2.1 茄子LOX家族基因的鑒定與基本信息

在浙江紫紅線茄(杭茄類型)的基因組中一共鑒定到12個LOX基因，然后依據這12個LOX基因在染色體上的位置依次命名為SmeLOX1～SmeLOX12。分別對這12個LOX家族蛋白的氨基酸(aa)長度、蛋白質相對分子質量(MW)、芳香度(aromaticity)、不穩定指數(instability index)、等電點(protein isoelectric point)和親水性(gravy)進行了統計和分析。結果顯示，LOX蛋白氨基酸序列長度介于793～909 aa，其中，SmeLOX6蛋白氨基酸序列長度最長，為909 aa，SmeLOX7蛋白氨基酸序列長度最短，為793 aa；這12個蛋白的相對分子質量介于90 715.48～103 351.01 u，其中SmeLOX6蛋白的相對分子質量最大，為103 351.01 u；芳香度介于0.09～0.11；蛋白不穩定指數介于37.98～53.28；等電點介于5.41～8.54；所有蛋白的總平均親水性系數均為負值，推測這12個蛋白均為親水性蛋白質(表2)。

表2 茄子LOX家族基因基本信息

2.2 茄子LOX家族基因的染色體定位

從繪制出的茄子LOX家族基因染色體分布圖(圖1)可以看出，12個LOX基因在4條染色體上(E01、E03、E08和E09)呈不均勻分布。其中，分布在E01染色體上的LOX基因數量最多，有5個；在E03和E09染色體上均有3個LOX基因分布；E08染色體上基因數量最少，只有1個LOX基因分布(圖1)。SmeLOX蛋白序列比較發現，SmeLOX家族蛋白氨基酸序列間的相似性為34.7%～89.0%(圖2)。

圖1 SmeLOX家族基因在茄子染色體上的位置分布Fig.1 Distribution of SmeLOX gene family on Solanum melongena chromosomes

圖2 SmeLOX家族蛋白氨基酸序列相似性Fig.2 Amino acid sequence identities and similarities of LOX family proteins in Solanum melongena

2.3 茄子LOX家族系統進化關系

為了明晰茄子LOX蛋白家族成員與其他物種中已知LOX家族成員的進化關系，將茄子LOX家族蛋白的氨基酸序列與來自其他17個物種的123個LOX蛋白氨基酸序列構建了進化樹(圖3)。進化樹中LOX家族蛋白被分為9-LOX和13-LOX兩個亞家族，其中13-LOX亞家族又被分為Type I型和Type II型兩類。茄子的12個LOX家族蛋白中，屬于9-LOX亞家族的有6個(SmeLOX1、SmLOX2、SmeLOX3、SmeLOX9、SmeLOX11和SmeLOX12)，屬于Type II 13-LOX亞家族的有5個(SmeLOX4、SmLOX5、SmeLOX6、SmeLOX7和SmeLOX8)，SmeLOX10蛋白屬于Type I 13-LOX亞家族。此外，系統發育樹中9-LOX分支又可以劃分為單子葉植物組和雙子葉植物組，表明9-LOX亞家族在單子葉和雙子葉植物進化過程中出現了分化。

Gm，大豆；Hv，大麥；Lc，扁豆；Le，番茄；Na，野生煙草；Nt，紅花煙草；Os，水稻；Ps，豌豆；Pv，菜豆；St，馬鈴薯；Zm，玉米；Vv，葡萄；Pt，楊樹；Rsa，蘿卜；At，擬南芥；Bra，白菜；Bol，甘藍。Gm，Glycine max; Hv，Hordeum vulgare; Lc，Lens culinaris; Le，Lycopersicon esculentum; Na，Nicotiana attenuate; Nt，Nicotiana tabacum; Os，Oryza sativa; Ps，Pisum sativum; Pv，Phaseolus vulgaris; St，Solanum tuberosum; Zm，Zea mays; Vv，Vitis vinifera; Pt，Populus trichocarpa; Rsa，Raphanus sativus; At，Arabidopsis thaliana; Bra，Brassica rapa; Bol，Brassica oleracea.圖3 SmeLOX家族蛋白的系統發育及其分類Fig.3 Phylogenetic relationships and classification among LOX family proteins from Solanum melongena and other species

2.4 茄子LOX家族基因的基因結構與保守基序

為了進一步闡明茄子LOX家族基因結構與保守基序的變異，對茄子12個LOX蛋白氨基酸序列構建了單獨的系統發育樹，并對其相應的外顯子、內含子，以及編碼的保守基序進行了分析(圖4)。圖4-B是茄子中SmeLOX基因的結構示意圖，SmeLOX基因外顯子的數量均為14或15個，外顯子數量相似，表明它們在功能上可能有一定相似性。分析發現，9-LOX亞家族(SmeLOX1、SmLOX2、SmeLOX3、SmeLOX9、SmeLOX11和SmeLOX12)包含9～10個內含子，而13-LOX亞家族具有8～11個內含子。其中SmeLOX4和SmeLOX10的內含子最少，為8個，而SmeLOX6和SmeLOX8的內含子最多，有11個(圖4-B)。

A，茄子SmeLOX蛋白系統發育樹；B，茄子SmeLOX基因的內含子和外顯子結構圖；C，SmeLOX蛋白保守基序的示意圖；D，茄子SmeLOX蛋白具有的38個氨基酸殘基的保守基序；E，茄子SmeLOX蛋白保守基序的序列比對。A，Phylogenetic tree of SmeLOX proteins;B，Exon-intron structures of SmeLOX gene; C，Schematic representation of the conserved motifs in SmeLOX protein; D，A 38-residue sequence motif of SmeLOX protein;E，Alignment of a 38-residue conserved motif of SmeLOX protein.圖4 茄子SmeLOX家族基因和蛋白結構分析Fig.4 Analyses of structure of SmeLOX family genes and proteins inSolanum melongena

為了深入了解茄子中LOX家族的潛在功能和多樣性，對LOX家族蛋白序列的保守性進行了分析。如圖4-C所示，茄子LOX家族蛋白有15個保守的motif，在這15個motif中，有12個motif(motif 1～11和14)廣泛存在于每一個茄子的LOX蛋白中。其中，motif 1是LOX蛋白的典型結構域，是由38個氨基酸組成的富含組氨酸的結構(His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His)，在茄子SmeLOX蛋白中高度保守(圖4-D和E)。

2.5 茄子LOX家族基因的表達模式

為了闡明茄子LOX家族基因的表達模式，采用qRT-PCR的方法對茄子12個SmeLOX基因在茄子5種組織(根、莖、葉、花、果實)中的表達模式進行了分析。結果(表3)顯示，除SmeLOX2和SmeLOX7基因在莖稈中不表達，SmeLOX3基因在根和花中不表達，SmeLOX5和SmeLOX9基因在根中不表達，SmeLOX10基因在花中不表達，SmeLOX11基因在果實中不表達，SmeLOX12基因在根和花中不表達外，其余4個SmeLOX基因在茄子5種組織中均有表達。其中，SmeLOX1和SmeLOX4基因在茄子花和果實中的相對表達量高于根等其他組織，SmeLOX6基因在根中的表達量高于花等其他組織；SmeLOX8基因在花、莖稈和果實中均有較高表達。

表3 qRT-PCR分析SmeLOX家族基因在茄子不同組織部位的相對表達水平

3 結論與討論

LOX家族蛋白在植物的生長發育、逆境脅迫和病菌防御等過程中具有重要作用，盡管其在擬南芥、番茄、黃瓜等植物中已經被鑒定；但在茄子中，LOX家族基因尚未被鑒定和分類。本研究基于茄子“HQ-1315”參考基因組數據，采用生物信息學分析方法，對茄子中的LOX家族基因成員個數、染色體定位情況、基因的結構與保守結構域進行了分析。同時，采用qRT-PCR測定了茄子不同組織中SmeLOX基因的相對表達量。

本研究在茄子中共鑒定出12個SmeLOX基因，數量大于大麥(7)、水稻(10)、玉米(2)等糧食作物[22-23]，以及辣椒(8)、馬鈴薯(5)和番茄(5)等茄科植物[24-26]。氨基酸序列比對和系統發育樹結果顯示，茄子LOX家族被分為9-LOX和13-LOX兩個亞家族。與前人報道的類似；根據LOX氨基酸序列相似性和有無葉綠體運輸多肽，茄子13-LOX亞家族又被進一步分為Type I 13-LOX和Type II 13-LOX；有6個SmeLOX屬于9-LOX亞家族，1個SmeLOX屬于Type I 13-LOX亞家族，5個SmeLOX屬于Type II 13-LOX亞家族。進一步分析發現，LOX家族蛋白在單雙子葉植物中存在不同的進化模式。系統發育樹中9-LOX亞家族中單子葉和雙子葉植物的LOX蛋白形成單獨的進化枝，Type I 13-LOX亞家族LOX蛋白的進化枝中僅含有雙子葉植物，表明Type I 13-LOX亞家族LOX蛋白可能是在雙子葉植物分化后進化產生的，而9-LOX和Type Ⅱ 13-LOX亞家族可能在單、雙子葉植物分化之前已經存在。

有報道表明，脂氧合酶富含組氨酸(His)殘基的保守基序[His-(X)4-His-(X)4-His-(X)17-His-(X)8-His]，其對脂肪酸氧和酶的穩定性和活性具有重要影響[27]。SmeLOX家族的蛋白結構分析結果表明，茄子SmeLOX蛋白均具有此保守基序，與前人報道一致。植物LOX催化細胞膜脂的過氧化反應產生的氫過氧化物和含氧自由基等多種物質，可參與細胞內的多種信號傳導，對植物抵御環境脅迫起著重要調節作用[28]。研究表明，植物中LOX活性在受到極端天氣、病原菌、高溫和機械損傷等多種非生物和生物脅迫下會顯著升高，從而增強對逆境脅迫的抗性[4]。系統進化樹分析結果表明，茄子LOX家族蛋白可能在生物和非生物脅迫過程中發揮著重要作用。系統進化樹中，SmeLOX4和SmeLOX5蛋白與番茄LeLOX4、馬鈴薯StLOX4、煙草NaLOX3親緣關系十分相近，而這幾個蛋白均被報道參與植物對病原菌等生物脅迫的防御反應[29-30]。楊樹中PtLOX12和PtLOX14基因的表達受茉莉酸甲酯的誘導[31]，茄子中SmeLOX6和SmeLOX7蛋白與PtLOX12和PtLOX14蛋白親緣關系較近，推測SmeLOX6和SmeLOX7可能在植物抗病中起重要作用。此外，SmeLOX10與13-LOX亞家族中茄子的其他SmeLOX蛋白親緣關系較遠，推測SmeLOX10蛋白可能在茄子中具有獨特的功能。

LOX家族基因在植物不同組織中的表達存在顯著差異，例如，黃瓜中有3個LOX基因在根中的表達量比其他組織高[15]，甜瓜中CmLOX15僅在生殖器官中表達[32]。本研究中，SmLOX基因在茄子不同組織的表達量也存在顯著差異，表明茄子LOX家族基因可能參與茄子不同器官組織的發育過程。

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