三株降解阿特拉津菌株的特性與固定載體分析

劉丹丹，孫宛玉，王 鶴

(沈陽化工大學 環境與安全工程學院，遼寧 沈陽 110142)

隨著農業現代化進程加速，人們對農產品的需求增大，農藥成為農業生產中的必需品[1]。其中除草劑的大量使用會對環境以及人類健康產生巨大的負面影響。三嗪類化合物阿特拉津是世界范圍內使用最廣泛的除草劑之一[2-3]，它通過抑制植物的光合作用持久防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草，常用于甘蔗田、茶園、林地和果園等地[4-5]。阿特拉津具有半衰期長、遷移率高、吸附系數低的特點。它會隨雨水浮沉和地表揮發遷移到周邊環境中造成附近土壤及水體污染。長期施用阿特拉津會導致農藥殘留嚴重危害環境安全和生物的健康[6-7]，因此緩解阿特拉津污染問題迫在眉睫。

目前，利用生物修復技術治理土壤污染是國內外公認的最有效方法[8]。生物修復技術與物理、化學處理方法相比，修復過程會更安全、不易產生二次污染，更適合用于大面積土壤污染的治理[9-10]。研究表明，在實際環境中微生物極易受土壤性質(PH、鹽度等)和環境條件(溫度、光照等)的影響，造成微生物修復土壤效果不理想[11]。但通過固定化微生物技術可以有效彌補其在自然環境中的不足[12-13]，常用的固定化材料有粘土、活性炭、多孔玻璃、海藻酸鈉、明膠和聚乙烯醇等[14]，其中海藻酸鈉憑借無毒無污染、操作簡單、價格低廉、傳質性能好等優點被廣泛使用[15]。

本研究從長期受阿特拉津污染的土壤中篩選出3株高效降解阿特拉津的菌株。經過生態學觀察、生理生化分析及16S rDNA鑒定確定菌株種屬，并通過氣相色譜和分光光度法揭示菌體生長和降解效果的關系。比較海藻酸鈉、聚乙烯醇、明膠和生物炭4種材料包埋菌株后的物理性質及對阿特拉津的降解效果，選出最佳包埋載體。以期為生物修復阿特拉津環境污染提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養基

無機鹽培養液：磷酸氫二鉀0.8 g，磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸鎂0.1 g，氯化鈉0.05 g，葡萄糖1.5 g，阿特拉津0.05 g，蒸餾水定容至500 mL，PH調至中性，121℃高壓滅菌30 min[8]。

LB培養基：胰蛋白胨5.0 g，氯化鈉5.0 g，酵母浸粉2.5 g，瓊脂粉10 g，蒸餾水定容至500 mL，pH調至中性，121℃高壓滅菌30 min[8]。以上所有試劑均為分析純。

阿特拉津(純度約99.9%，購自Sigma公司)，丙酮，二氯甲烷(均為色譜級)。

阿特拉津標準液：稱量0.1 g阿特拉津溶解在1 000 mL丙酮中，制備100 mol·L-1阿特拉津標準溶液。

菌懸液制備：將3株菌在液體培養基中培養24 h，8 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，無菌水沖洗菌體，生理鹽水重懸，30 ℃下150 r·min-1繼續培養6 h，用無菌水調節菌懸液D600為1.0備用。

1.2 供試菌株分離、純化和培養

從長期施用阿特拉津的污染土壤中篩選出3株菌株，在含阿特拉津50 mol·L-1的無機鹽液體培養基中培養，通過不斷增加培養液中阿特拉津濃度提升菌株降解能力，直至阿特拉津濃度為100 mol·L-1，對馴化后菌株分離純化。菌株現存放于沈陽化工大學環境工程實驗室。

1.3 降解菌株形態學與生理生化鑒定

降解菌株于LB培養基培養，觀察LB培養基及掃描電鏡中菌株的形態，菌株掃描電鏡前處理方法參照尤嘉懿[16]。生理生化特征鑒定實驗方法參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[17]。

1.4 降解菌株16S rDNA鑒定與系統發育樹構建

細菌總DNA提取采用CTAB法[18]。16S rDNA鑒定采用Takara試劑盒，反應體系為50 μL，包括引物(5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′，5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)1 μL，DNA模板1 μL，PCR混合液25 μL，雙蒸水23 μL。PCR反應條件為94 ℃，預變性5 min，30個循環(94 ℃變性1 min，58℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min)，72 ℃延伸5 min，4 ℃穩定4 min。產物用OMEGA D2500-02(購自索萊寶科技公司)試劑盒回收，送至金唯智生物科技有限公司測序。測序所得序列經Blast比對后，選出相似菌株序列，用MEGE7.0軟件進行系統發育分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹[19]。

1.5 阿特拉津降解率測定

分別取10 mL菌懸液(1×108CFU·mL-1)，加入100 mol·L-1阿特拉津培養液中，避光培養5、8、11、14、17、20 d后，通過氣相色譜測定阿特拉津的降解率[20]。

1.5.1 樣品前處理

取不同時間的菌株培養液100 mL，抽濾后，加入氯化鈉5.0 g，二氯甲烷15 mL，萃取20 min，取下層有機相，旋轉蒸發儀45 ℃濃縮后，丙酮定容至1 mL[21]，用氣相色譜測定。

未添加菌株的阿特拉津無機鹽培養液為空白對照組，處理方法同上。

1.5.2 氣相色譜檢測條件

氣相色譜儀：天美氣相色譜儀GC7900，氫火焰離子化檢測器(FID)。色譜柱：天美TM-5石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，內涂5%苯基甲基聚硅氧烷，膜厚0.25 μm)，1 μL微量進樣器。

進樣口溫度為240 ℃，采用分流進樣，分流比10∶1。柱箱升溫程序：初始溫度40 ℃，保持30 min；以30 ℃·min-1升至190 ℃，保持5 min；以30 ℃·min-1升至250 ℃，保持5 min。以N2為載氣，流量1.0 mL·min-1。檢測器溫度300 ℃，進樣體積1.0 μL[21]。

1.5.3 阿特拉津降解率計算

菌株降解率的計算參照葛世杰等[22]計算公式如下：

(1)

式(1)中：X為阿特拉津降解率(%)；CX為阿特拉津的最終濃度(mol·L-1)；CCK為阿特拉津的原始濃度(mol·L-1)。

1.6 菌體生長情況測定

采用分光光度法[23]測定5、8、11、14、17、20 d培養液在600 nm波長下的D值(D600)，了解菌體的生長狀態。

1.7 固定化菌株制備

海藻酸鈉包埋：取10 mL菌懸液與10 mL濃度為5%海藻酸鈉溶液混勻，用注射器將混合液緩慢滴入100 mL濃度為4%的氯化鈣溶液中，室溫交聯4 h，取出小球，用無菌水沖洗3次，4℃冷藏備用[24]。

聚乙烯醇包埋：取10 mL菌懸液與10 mL濃度為10%聚乙烯醇溶液混勻，用注射器將混合液緩慢滴入100 mL濃度為5%的硼酸溶液中，室溫交聯4 h，取出小球，處理同上[25]。

明膠包埋：將10 mL菌懸液與10 mL濃度為10%明膠溶液混勻，倒入培養皿中凝固后，加入10 mL 0.5%戊二醛溶液，室溫交聯4 h切成小塊，處理同上[26]。

生物炭固定：稱取1 g生物炭，倒入10 mL菌懸液搖勻，室溫交聯4 h，處理同上。

1.8 包埋菌株物理性能和降解效果測定

分別從不同的固定方式中選取大小均勻的固定化菌體備用。

機械強度測定：將100粒固定化菌體放入含有200 mL蒸餾水的錐形瓶中，以200 r·min-1震蕩24 h，統計未破損顆粒占總顆粒的比例。

傳質性能測定：將100粒固定化菌體浸沒于紅墨水中2 h，將其置于無菌水中24 h，觀察其染色、褪色情況，判斷傳質性能的優劣[27]。

成形性測定：觀察固定24 h的菌株成球難易、黏連情況和拖尾現象[24]。

阿特拉津降解率：選取等量大小均勻的固定化菌體投入到100 mol·L-1含阿特拉津的液體培養基中，同時以未固定的游離菌株為對照。培養14 d通過氣相色譜測定其降解率，處理方法同1.5節。

2 結果與分析

2.1 降解菌株形態學及生理生化鑒定

對平板及掃描電鏡中菌株形態進行觀察，8號為圓形淡黃色短桿菌，表面光滑且不透明，菌落邊緣規則；9號為圓形乳白色短桿菌，表面粗糙且不透明，菌落邊緣不規則；10號為圓形淡黃色長桿菌、表面光滑且不透明，菌落邊緣不規則有透明圈。菌株在LB培養基及掃描電鏡下形態見圖1和圖2。

圖中A～C分別為8、9、10號菌株，圖片為菌株×20 000倍下的電鏡圖片。A-C reprent No. 8-10 respectively. The picture shows the strain ×20 000.圖2 三菌株掃描電鏡下形態(×20 000)Fig.2 Morphology of 3 strains under scanning electron microscope (×20 000)

經生理生化分析可知，3種菌株均為革蘭氏陽性菌株，且對葡萄糖、蔗糖和乳糖作用一致，除9號菌株在檸檬酸鹽利用實驗中呈陽性外，其余實驗結果3菌株均相同，具體結果見表1。

表1 三株降解菌生理生化鑒定結果

通過觀察分析，發現3株降解菌與Shinella、Herbaspirillum和Pseudomonas菌屬的形態和生理生化特性一致。

2.2 降解菌株菌屬鑒定

經16S rDNA鑒定可知，8、9、10號菌株16S rDNA序列長度分別為1 225、1 223和1 227 bp。通過Genbank數據庫進行Blast比對，結果表明，8、9、10號降解菌株分別與Shinella菌屬、Herbaspirillum菌屬和Pseudomonas菌屬最為相似，相似度分別達97%、97%和96%，選取相似菌株繪制進化樹，可看出8、9、10號菌株分別與申氏菌屬、草螺菌屬和假單胞菌屬聚為一枝(圖3)。

括號內為菌株的登錄號。The accession number of the strain is shown in brackets.圖3 三菌株16S rDNA系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA

2.3 菌株降解效果及生長情況

經氣相色譜測定3株菌分別在2.796、2.821、2.831 min有明顯的吸收峰(圖6)。通過公式計算降解率，并進一步比較不同培養時間的降解效果，菌株8、9、10號均在14 d降解率最高，分別為88.1%、87.2%和89.9%。

采用分光光度法測定5 、8 、11 、14 、17 、20 d后不同培養液的D600，結果表明，在5～20 d 期間D600逐漸增加，14 d時D600均達到1.0左右。

菌株對阿特拉津的降解率與生長情況見圖4和圖5。

圖中A～C分別為8、9、10號菌株在5～20 d對阿特拉津的降解率。In the figure，A-C are the degradation rates of atrazine by strain No. 8-10 on 5 days to 20 days，respectively.圖4 三菌株對阿特拉津的降解情況Fig.4 Degradation of atrazine by 3 strains

圖5 三菌株在5～20 d生長情況Fig.5 The growth of the 3 strains from 5 days to 20 days

2.4 包埋菌體物理性能和降解效果

通過計算未破損顆粒占總顆粒的比例、觀察包埋菌體的染色褪色、成形性情況得知不同載體包埋3株菌的物理性能見表2。經計算，8、9、10號菌株由海藻酸鈉包埋的降解率分別為85.4%、82.6%和86.4%，由聚乙烯醇包埋的降解率分別為41.4%、45.4%和44.4%，由明膠包埋的降解率分別為65.4%、57.4%和66.5%，由生物炭包埋菌株的降解率分別為55.2%、56.8%和55.4%，游離菌株降解率分別為88.0%、86.1%、88.0%見圖8。結果表明海藻酸鈉包埋菌株成形性、機械強度較好、褪色速率快、傳質能力最佳、而且對菌株降解效果影響最小。聚乙烯醇的機械強度較好但傳質能力和成形性極差，對阿特拉津的降解率最低。明膠的機械強度差，生物炭的成形性、機械強度最好，但二者的傳質能力一般且對阿特拉津的降解效果一般。綜合比較4種包埋載體，最終選定海藻酸鈉為最佳載體，4種固定后菌株形態見圖7。

圖中A～C分別為第8-10號菌株對阿特拉津降解氣相色譜圖。In the figure，A-C are gas chromatography of atrazine degradation by strain No. 8-10.圖6 8-10號菌株對阿特拉津降解氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatography of atrazine degradation by strain No. 8-10

A，海藻酸鈉；B，聚乙烯醇；C，明膠；D，生物炭。A，Sodium alginate; B，Polyvinyl alcohol; C，Gelatin; D，Biochar.圖7 四種固定化菌株形態Fig.7 Forms of four immobilized bacterial strain agents

圖8 四種載體固定化3菌株14 d對阿特拉津降解率Fig.8 Atrazine degradation rate of 3 strains immobilized on 4 carriers for 14 days

表2 不同載體包埋菌體后物理性能測定結果

3 結論與討論

此前，報道過具有降解阿特拉津的功能菌屬有：Micrococcusluteus、Exiguobacteriumsp、Rhodococcus和Pseudomonas等[28-30]，但關于Shinella和Herbaspirillum菌屬降解阿特拉津的相關研究鮮有報道。徐艷婷等[31]、劉冰冰[32]發現，Shinella菌屬可以高效降解氨氮、具有絮凝銅綠微囊藻且能降解土壤中三價砷和乙草胺類除草劑；劉偉林等[33]發現，Herbaspirillum菌屬有固氮的作用，可以促進植物的生長。Herbaspirillum菌屬還具有良好的好氧反硝化性能，多用于廢水脫氮處理[34]。本研究以尋求高效降解阿特拉津菌株和最佳包埋載體為目的，從長期受阿特拉津污染的土壤中篩選出3株菌，經過對菌株的形態觀察、生理生化特性分析、16S rDNA測序比對及系統發育樹的構建，確定8、9、10號菌株屬Shinella、Herbaspirillum和Pseudomonas。又通過氣相色譜測定3菌株降解率，經計算可知在14 d后菌株降解率最高均達到85%以上，證明了3菌株對阿特拉津起降解作用。同時依據分光光度法測定的D600推測菌株生長情況，結果表明，5～11 dD600不斷增加，則是菌量在逐漸增長。14 d的菌量達到最大、菌株生長代謝最旺盛，D600達到1.0左右。結合阿特拉津降解率和菌株生長情況表明，菌株降解效果與菌量呈正相關，即隨著菌量的增加，菌株的降解率也不斷提高，當D600達到1.0左右時降解率最高。有關于8、9、10號菌株是否具有降解其他農藥的作用還有待進一步驗證。

近些年，利用包埋菌株修復阿特拉津污染的技術備受歡迎。宋昊等[35]已證實包埋法固定菌株可以提高菌株對惡劣環境的耐受能力從而達到保護菌株的目的。本實驗選取了4種載體，綜合比較不同的載體包埋情況。結果表明，海藻酸鈉固定菌體的成球性好、破損率低、傳質能力較強且對菌株降解阿特拉津的影響小。同時在實際應用中，海藻酸鈉的成本低且易獲取，其包埋技術操作簡單、修復效果好，這與楊曉燕等[24]研究結果一致，因此我們認為海藻酸鈉是最佳包埋載體材料。該研究結果可為菌株在實際環境中施用，緩解阿特拉津污染土壤問題，提供可行的解決思路。

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