恩施產區湖北貝母乙酸乙酯組分揮發性成分與抗菌活性研究

李 宇，劉翠君，艾倫強，方昕悅，劉 玉，袁名遠，冉亞蘭，何美軍，*

(1.湖北省農業科學院 中藥材研究所，國家中藥材產業技術體系恩施綜合試驗站，湖北 恩施 445000； 2.湖北民族大學 生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000； 3.恩施土家族苗族自治州農業農村局，湖北 恩施 445000)

湖北貝母(FritillariahupehensisHsiao et K. C. Hsia)，屬百合科貝母屬(FritillariaL.)，主要分布于長江流域地區[1]。湖北貝母具有清熱化痰、止咳、散結的功效，傳統用于治療熱痰咳嗽、瘰疬痰核、癰腫瘡毒[2]。藥理實驗表明，湖北貝母總生物堿具有舒張離體氣管平滑肌、鎮咳[3]、平喘[4]、降壓[5]以及抗癌[6]等作用。貝母素乙(peiminine)，別名浙貝乙素，是湖北貝母中被鑒定的主要活性生物堿成分之一[7]，具有減輕急性肺損傷[8]、治療骨關節炎[9]、抗癌[10]等重要生理活性。湖北貝母還富含萜類化合物如fritilleinide A、fritillebin C、fritillahupehin等，脂肪酸類化合物如棕櫚酸、二十四烷酸和壬二酸等，其相關活性尚無文獻報道[5]。

主產于湖北恩施地區的湖北貝母，是湖北省恩施州的重要道地藥材[11]。因此，展開恩施產區的道地藥材湖北貝母活性研究對于當地藥材產業具有重要意義。本實驗研究了湖北貝母提取物乙酸乙酯組分揮發性組分的組成、抑菌活性、貝母素乙含量，為湖北貝母的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

貝母樣品從恩施周邊地區采集，由湖北省農業科學院中藥材研究所鑒定。

試驗儀器包括：DFY-1000中草藥磨粉機(溫嶺市林大機械有限公司)，Aglient Technologies 7890A/5975C GC-MS聯用儀(安捷倫科技有限公司)，agilent 19091S-433毛細管柱(HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm)(安捷倫科技有限公司)，NanoDropTMOne超微量紫外分光光度計(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，CR-80CO2培養箱(廣州市康恒儀器有限公司)等。

標準品貝母素乙購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其余試劑均為國產分析純。所有供試菌都由中國科學院南海海洋研究所中國科學院熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室鑒定。

LB培養基配制：酵母提取物5 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min(固體LB培養基加入瓊脂20 g·L-1)。

MH液體培養基配制：牛肉粉2 g·L-1，可溶性淀粉1.5 g·L-1，酸水解酪蛋白 17.5 g·L-1，pH 7.2～7.6，121 ℃滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 貝母乙酸乙酯組分獲得

10 g干燥貝母粉碎，按料液比1∶50(g·mL-1)，乙醇溶液(體積分數60%)浸泡18 h，500 W超聲輔助浸提30 min，10 000 r·min-1離心獲得上清液，減壓旋蒸，得到乙醇提取物浸膏。再用乙酸乙酯萃取(萃取3次，每次間隔2 h)，減壓濃縮，獲得貝母乙酸乙酯組分。

1.2.2 貝母乙酸乙酯組分揮發性成分檢測

氣相色譜條件：Agilent 19091S-433毛細管柱(HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm)；100 ℃保持3 min，15 ℃·min-1升至280 ℃，保持5 min，然后2 ℃·min-1升至300 ℃保持10 min，總運行時間40 min；進樣口溫度為310 ℃；載氣為高純度氦氣(99.999%)；流速為1.8 mL·min-1；進樣量為5 μL；不分流。

質譜條件：電子轟擊(EI)離子源；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；電子能量70 ev，接口溫度250 ℃，質量掃描范圍30～500 amu，檢索譜庫為NIST08.LIB標準譜庫鑒定揮發性成分，采用面積歸一化法對揮發油成分進行定量分析[12]。

樣品處理：貝母乙酸乙酯組分用二氯甲烷充分溶解，13 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液進樣分析，以分析純二氯甲烷進樣作為對照組，每組樣品進樣3次，作為3個重復。

1.2.3 貝母乙酸乙酯組分活性成分GC定量

采用氣相色譜外標法[13]檢測湖北貝母中貝母素乙的含量，設定貝母素乙標準品質量濃度：1.13、2.25、4.50、6.75、9.00、11.25 mg·mL-1。運用FID檢測器，設置檢測器溫度為310 ℃，運用1.2.2節的氣相色譜條件測定儀器信噪比(S/N)，當貝母素乙標準溶液稀釋至信噪比3

1.2.4 貝母乙酸乙酯組分抗菌活性測試

采用濾紙片法[14]測試湖北貝母乙酸乙酯組分對11株供試菌的抑菌活性，取20 μL培養至D600為0.6的測試菌菌液與20 mL LB固體培養基混合均勻倒平板。取10 μL湖北貝母乙酸乙酯組分(二甲基亞砜DMSO溶解)，分三次滴加于濾紙片(直徑為4.45 mm)上，將濾紙片置于混有菌液的培養基上，另設氨芐青霉素(100 mg·mL-1)作陽性對照、添加DMSO作陰性對照，37 ℃培養12 h，測抑菌圈直徑。參照抗生素藥敏標準：高敏(抑菌圈直徑>20 mm)、中敏(10～20 mm)、輕敏或耐藥(<10 mm)。采用微量肉湯稀釋法測定湖北貝母乙酸乙酯組分對供試菌的MIC值，按美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)M07-A10[15]的標準操作程序：在96孔板上3～12列的每孔加入含湖北貝母乙酸乙酯組分樣品的MH液體培養基100 μL，設置湖北貝母乙酸乙酯組分終濃度分別為189.69、94.84、47.42、23.71、11.86、5.93、2.37、1.00、0.50、0.25 mg·mL-1(3～12列)。將培養好的菌液稀釋1 000倍，每孔加入稀釋菌液100 μL，設氨芐青霉素(100 μg·mL-1)作陽性對照組，第1列為空白培養基對照組，第2列為菌液生長空白對照組(加DMSO)，第3～12列為樣品測試實驗組。37 ℃培養16 h后使用NanoDropTMOne超微量紫外分光光度計檢測D600，根據CLSI M100—S25標準[16]：與陽性生長對照組比較，抑制80%細菌生長的藥物濃度為受試菌的MIC值。

1.3 數據處理

所有實驗數據運用SPSS 19.0 軟件進行統計分析，實驗數據以“平均值±標準偏差”表示。P<0.05，表明具有顯著性差異，P<0.01，表明具有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 貝母乙酸乙酯組分揮發性成分鑒定及相對含量測定

通過GC-MS分析共從湖北貝母乙酸乙酯組分中鑒定出223個離子峰(圖1)，這些離子峰的質譜數據在NIST08.LIB標準譜庫中檢索，匹配度≥90.0%，鑒定為同一個化合物。通過質譜數據共從湖北貝母乙酸乙酯組分中鑒定出16個揮發性代謝產物(表1)。

圖1 總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram

表1 貝母乙酸乙酯組分揮發性成分及其含量測定結果

鑒定的湖北貝母乙酸乙酯組分揮發性物質主要包括脂肪烴、脂肪酸、含硫化合物和含氮的生物堿。如表1所示，脂肪烴類化合物有(1)、(2)、(4)、(5)、(10)、(14)共6個。脂肪酸類化合物有(3)、(7)、(8)、(9)、(12)、(13)共6個，其中(3)、(12)、(13)為不飽和脂肪酸，飽和脂肪酸類化合物的重要生理功能具有供應能量、增加膽固醇的濃度，但同時也能調節低密度脂蛋白(low-density lipoprotein)的代謝的作用，不飽和脂肪酸類化合物具有降低心腦血管疾病發生和調節膽固醇與血脂、降低血壓作用、抗腫瘤和保護視力的作用[17]。化合物(15)、化合物(16)是生物堿類化合物，化合物(15)是首次在湖北貝母中鑒定的含氮生物堿，化合物(16)是貝母素乙。

采用GC-MS峰面積歸一法定量分析，計算出各成分的相對含量(表1)。從乙酸乙酯組分中共檢測出223個色譜峰，通過NIST08.LIB標準譜庫鑒定16 種化合物(匹配度≥90.0%)，占總相對含量的51.64%，主要成分為脂肪烴(4.55%)、脂肪酸(24.07%)，以及含氮的生物堿(23.02%)。

2.2 貝母乙酸乙酯組分貝母素乙含量測定

通過GC 外標法測量貝母素乙標準品的檢出限、定量限分別為15.77、52.57 μg·mL-1(6次重復實驗)，說明檢測器靈敏度極高，適合用于檢測。

貝母素乙在檢測濃度1.13～11.25 mg·mL-1范圍內，線性相關性好(R2≥0.999 0)，標準曲線方程為y=13.33×A+4.89。配制本底濃度為1.00 mg·mL-1的貝母素乙標準品溶液，再向貝母素乙標準品溶液中準確添加貝母素乙標準品，使標準溶液濃度增加為0.80 mg·mL-1(已知加標量)，得到貝母素乙標準品溶液的計算濃度為1.80 mg·mL-1。運用GC檢測添加貝母素乙標準品后的溶液濃度為1.76 mg·mL-1。獲得標準品的加標回收率為95%，相對標準偏差(RSD)為3.68%，證明通過GC檢測貝母素乙的方法準確、重現性好且靈敏度較高。

利用GC外標法檢測湖北貝母乙酸乙酯組分的貝母素乙含量為(16.19±0.16) mg·g-1，加標回收率為96.58%，相對標準偏差為3.98%(表2)，證明通過GC檢測貝母素乙的方法準確、簡便且靈敏度較高。

表2 湖北貝母乙酸乙酯組分貝母素乙含量表(means±SD，n=6)

2.3 貝母乙酸乙酯組分抗菌活性研究

濾紙片活性粗篩結果顯示，湖北貝母乙酸乙酯組分(25.00 mg·mL-1)對11株供試菌具有抗菌效果：貝母乙酸乙酯組分對蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、溶藻弧菌(VibrioalginolyticusXSBZ14)、鮑曼不動桿菌(AcinetobacterbaumanniiATCC 19606)有中度敏感抑制作用，其抑菌圈直徑大小分別為(13.32±1.08)、(12.18±0.88)、(12.15±0.47) mm。通過微量肉湯稀釋法測定湖北貝母乙酸乙酯組分對蘇云金芽孢桿菌、溶藻弧菌、鮑曼不動桿菌3株供試菌的MIC值，分別為2.37、5.93、11.86 mg·mL-1(表3)。

表3 湖北貝母乙酸乙酯組分的抗菌活性(means±SD，n=3)

貝母素乙在湖北貝母乙酸乙酯組分中的含量為(16.19±0.16) mg·g-1，以等量濃度的貝母素乙(0.41 mg·mL-1，25.00 mg·mL-1×1.62%)為對照組測試抑菌圈，首次發現貝母素乙對金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 29213)、鮑曼不動桿菌(AcinetobacterbaumanniiATCC 19606)、表皮葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusepidermidis)有微弱的抑菌活性。其抑菌活性與湖北貝母乙酸乙酯組分的抑菌活性存在顯著性差異，證明貝母素乙不是湖北貝母乙酸乙酯組分中主要發揮抑菌活性的成分。

3 討論與結論

目前用于檢測湖北貝母中貝母素乙等生物堿含量的主要方法是高效液相色譜-蒸發光散射檢測法(HPLC-ELSD)[18-19]。ELSD檢測的基本原理：被檢測樣品隨流動相進入霧化器中，與載氣混合形成均勻一致的霧滴；霧滴在通過蒸發器時，流動相被蒸發，被檢測樣品形成極細的霧狀顆粒；霧狀顆粒高速通過檢測器的光路，并形成信號輸出[20]。該方法主要受樣品組分和流動相的揮發性影響，只有非揮發性化合物，流動相為易揮發的溶劑才能檢測。該缺陷限制了揮發性樣品檢測，易揮發的溶劑的使用造成周圍空氣污染，其次樣品和溶劑的揮發性極大影響基線噪音、檢測靈敏度、檢測線性范圍[21]。

氫火焰離子化檢測器(FID)的基本原理：有機樣品隨載氣由噴嘴噴出并碰到氫火焰，在C層發生裂解反應并產生自由基；自由基反應導致火焰中大量水分子碰撞而發生分子離子化；離子化分子在檢測器中向兩極定向運動而產生微電流，并形成信號輸出。因此，氫火焰離子化檢測器是典型的質量型檢測器，對有機化合物的檢測具有極高的靈敏度[22]。

本研究首次開發了利用氣相色譜配氫火焰檢測器檢測貝母素乙的方法，該方法準確、重現性好、靈敏度高，其檢出限、定量限分別為15.77、52.57 μg·mL-1，在1.13～11.25 mg·mL-1的檢測濃度范圍內線性相關性良好。目前有文獻報道湖北貝母乙醇提取物對乙型溶血性鏈球菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有抑菌活性[20]。通過對湖北貝母乙醇提取物成分進一步萃取分離，獲得乙酸乙酯組分，本研究首次發現湖北貝母乙醇提取物中乙酸乙酯組分對蘇云金芽孢桿菌、溶藻弧菌以及鮑曼不動桿菌有中度敏感抑制作用；并首次通過GC-MS檢測從湖北貝母乙酸乙酯組分中共鑒定出16個揮發性物質，其中貝母素乙的含量為1.61%。

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