鈉?鉀?氯協同轉運蛋白1相關神經系統疾病研究進展

付旭陽 孫健淇 呂軍 石瑞麗

鈉?鉀?氯協同轉運蛋白1（NKCC1）作為人體內的重要離子轉運體，主要介導鈉、鉀、氯等離子由細胞外向細胞內轉運，對氯離子穩態的調控發揮重要作用。NKCC1存在多個磷酸化位點和啟動子甲基化位點，與其表達與活性調控密切相關，在多種神經系統疾病的發病過程中均能觀察到NKCC1的異常變化［1］。布美他尼作為NKCC1特異性抑制劑，可用于多種神經系統疾病的治療，如低劑量布美他尼用于治療小兒孤獨癥，可改善社交、互動和興趣受限行為［2］；針對動物缺血?再灌注腦損傷模型的研究顯示，布美他尼還可通過抑制NKCC1活性而發揮腦保護作用［3］。基于此，本文擬綜述NKCC1的最新研究進展并分析將NKCC1作為治療靶點治療神經系統疾病的可能性，為疾病防治提供新的研究思路。

一、NKCC1的結構與功能

1.NKCC1結構 鈉?鉀?氯協同轉運蛋白（NKCCs）屬于Slc12a家族，該家族包含數個基因，如編碼NKCC2的Slc12a1基因、編碼NKCC1的Slc12a2基因、編碼鈉?氯協同轉運蛋白（NCC）的Slc12a3基因、編碼鉀?氯協同轉運蛋白（KCC）1~4的Slc12a4?7基因等［4］。人類NKCC1共包含1212個氨基酸殘基，轉錄本為7.4 kb，相對分子質量131.4×103，其編碼基因位于第5號染色體［5］。NKCC1擁有較大的氨基端（N端）和羧基端（C端），N端大部分無序，包含調控區域，其中的氨基酸磷酸化狀態決定了NKCC1的生物活性，不同物種的NKCC1蛋白N端具有序列多樣性［6］。人類細胞試驗顯示，NKCC1蛋白的N端具有糖基化修飾，約25%的NKCC1蛋白N端為復雜型N?糖基化，其余75%的NKCC1蛋白N端為高甘露糖糖基化和混合糖基化［7］。NKCC1蛋白經翻譯修飾后，約10%到達質膜，且大部分為高甘露糖型，其余90%的NKCC1蛋白分布在細胞內，其N端糖基化在NKCC1的協同轉運功能中發揮重要作用，但尚無證據表明糖基化與蛋白質在細胞內的定位有關［7］。NKCC1蛋白C端高度保守且與陽離子?氯化物協同轉運蛋白家族呈高度同源，其作用目前尚不明確，期待未來進行深入研究探討。

2.NKCC1功能 NKCC1表達廣泛，除外分泌上皮細胞，其在心臟、骨骼肌神經元等非分泌上皮細胞中也有分布。既往研究證明，NKCC1表達于中樞神經系統的全腦神經元、神經膠質細胞、脈絡叢上皮細胞、血管內皮細胞和周圍神經系統的背根神經節感覺神經元［4］；而近期有研究發現，腦卒中、膠質細胞瘤等中樞神經系統疾病亦可導致NKCC1表達異常［1，8］，同時NKCC1還參與不同組織細胞的離子穩態調節、細胞體積和質量調節，以及神經元信號轉導等正常生理功能［9］。正常情況下，Na+?K+?ATP酶提供能量并將鈉離子和鉀離子轉運至細胞外，而NKCC1以繼發主動轉運的方式消耗能量進行離子跨膜轉運，介導鈉、鉀、氯離子向細胞內轉運，調節離子穩態［9］。研究顯示，NKCC1通過離子轉運方式改變細胞滲透壓，調節細胞體積，在高滲環境下，細胞失水皺縮需觸發適當的調節機制以增大細胞體積，此時NKCC1被激活，介導離子向細胞內泵入，完成細胞體積的調節；當細胞處于低滲狀態時，細胞吸水膨脹，NKCC1呈低活性狀態，相反，KCC2被激活，介導鉀離子和氯離子外流，滲透壓降低，水分子隨之流出細胞，恢復細胞體積［10］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白1（mTOR1）受上游的生長因子和必需氨基酸調控，調節細胞生長［11］，近期研究發現［12］NKCC1對L型氨基酸轉運載體1（LAT1）和細胞表面抗原4F2重鏈（4F2hc）所形成的LAT1?4F2hc復合體發揮負調控作用，其在調控LAT1的同時降低mTOR1活性，通過此途徑參與細胞的生長調節。γ?氨基丁酸（GABA）是重要的抑制性中樞神經遞質，其受體為離子門控通道，當該通道被激活時，氯離子可由此流出或流入細胞。在正常生理狀態下，成人中樞神經系統KCC2呈高表達、NKCC1呈低表達［4］，當氯離子細胞內濃度低于細胞外時，GABA受體被激活，氯離子內流，細胞超極化；而在病理狀態下，NKCC1表達升高，氯離子轉運至細胞內，細胞內氯離子濃度升高，此時若GABA受體被激活，反使氯離子內流減少、胞膜超極化水平降低，甚至發生氯離子外流、細胞去極化［13］。上述研究提示，NKCC1可通過調控細胞內氯離子濃度，改變中樞神經系統GABA的生物學效應。不同神經元中NKCC1的作用有所不同，例如在視交叉上核中，大部分神經元可產生GABA作為神經元之間的轉導信號，GABA亦可使大部分神經元產生抑制性電位［14］，但有研究顯示，視交叉上核背側和腹側的GABA可以產生興奮性電位，并且這種興奮性作用可被NKCC1抑制劑布美他尼所阻斷［15］。總結上述兩項研究可以發現，GABA興奮和抑制電位的產生系由NKCC1功能狀態所決定的，NKCC1活躍時，氯離子濃度升高、產生興奮性電位，反之，則產生抑制性電位，提示這兩種不同的電位與NKCC1所介導的不同的細胞內氯離子濃度變化有關。晚近研究顯示，NKCC1表達受視交叉上核內環境光照調控［16］，NKCC1 mRNA在視網膜色素上皮細胞亦存在節律性表達，NKCC1表達量的改變可導致GABA產生不同的生物學效應，進而參與調節晝夜節律［17］。

二、NKCC1表達與活性的調控

NKCC1在人類胎兒期呈高表達，KCC2呈低表達，隨著年齡的增長，NKCC1表達逐漸降低，KCC2表達逐漸升高，使GABA介導的神經元離子電化學反應由超極化向去極化轉變［18］。研究顯示，在胎兒成長過程中其體內的NKCC1活性隨著母體循環中催產素水平的增加而逐漸降低，使GABA能信號產生抑制性電位，后者在分娩過程中產生的鎮痛和神經保護作用可幫助胎兒適應分娩時的不良刺激，此為胎兒抗神經損傷的一種生理學機制［19］。而在病理或特定環境下，NKCC1的表達會因蛋白質磷酸化、DNA甲基化或炎性細胞因子刺激等因素的影響而發生改變［20?22］。

1.NKCC1的表達調節 研究顯示，轉錄因子信號轉導及轉錄激活蛋白2（STAT2）的可結合位點位于NKCC1轉錄起始點上游的30和500 bp處［23］，但有關STAT2對NKCC1表達變化的影響至今尚不十分清楚。DNA甲基化是表觀遺傳學機制之一，由DNA甲基轉移酶（DNMT）催化完成。DNA高甲基化與基因轉錄阻遏相關，DNA低甲基化可促進基因轉錄。在正常情況下，大鼠Slc12a啟動子甲基化水平隨其月齡的增加而逐漸升高，隨著DNA甲基轉移酶活性的增強，可使NKCC1的表達維持在低水平狀態；而自發性高血壓模型大鼠體內的DNA甲基轉移酶活性則隨其月齡的增加而呈逐漸衰減趨勢，Slc12a基因啟動子呈低甲基化水平，這可能是NKCC1在自發性高血壓人群中呈高表達的重要病生 理 學 機制［24］。Unal等［25］發現，與 健 康 對 照組 相比，顳葉癲 患者病灶組織中NKCC1甲基化水平表達異常，提示NKCC1可能通過甲基化改變其表達量，從而參與難治性顳葉癲 的發病過程。Lee等［1］采用DNA甲基轉移酶抑制劑5?azadC處理正常大鼠皮質組織切片，發現5?azad C可顯著提高NKCC1的表達；對大腦中動脈閉塞（MCAO）缺血大鼠模型的觀察亦發現腦缺血損傷大鼠皮質NKCC1相關mRNA和蛋白質表達水平均升高，且患側大腦皮質Slc12a外顯子1區DNA甲基化程度明顯低于健側，推測與NKCC1 mRNA及其蛋白質重新表達有關。該研究結果提示，DNA甲基化參與對NKCC1表達的調控。除此之外，一些炎性因子亦與NKCC1的表達變化存在一定關聯性。Weidenfeld和Kuebler［26］發現，腫瘤壞死因子?α（TNF?α）等炎性因子可上調急性肺損傷模型小鼠NKCC1的表達水平，TNF?α缺陷模型小鼠小腦及大腦皮質NKCC1表達均降低，注射TNF?α后其NKCC1表達顯著升高［27］，提示TNF?α具有促進NKCC1表達的作用。原代星形膠質細胞實驗顯示，TNF?α或白細胞介素?1β（IL?1β）可顯著增加NKCC1相關mRNA和蛋白質的表達，并可隨其體內濃度的降低而下調［28］。但上述研究仍不能明確炎性因子激活NKCC1表達的作用是否具有特異性，其他細胞因子是否也參與炎性損傷時對NKCC1表達的調節。

2.NKCC1的活性調節 1992年，Lytle和Forbush［29］首次報告NKCC1磷酸化對其功能的影響：NKCC1抑制劑布美他尼注射于經高滲溶液皺縮的鯊魚直腸腺細胞內即可見細胞內鉀離子濃度迅速升高，該作者認為細胞內鉀離子濃度的變化與NKCC1蛋白中絲氨酸和蘇氨酸殘基發生磷酸化有關。后續研究發現，NKCCs家族的生物活性與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（WNK）、STE20/SPS?1相關性脯氨酸?丙氨酸激酶（Spak）和氧化應激反應激酶（OSR1）磷酸化有關。與正常小鼠相比，Spak基因敲除小鼠感覺神經元NKCC1活性下降2倍，表明Spak參與了NKCC1的活化過程［30］。WNK3激活NKCC1的信號轉導通路需Spak/OSR1的參與，Spak/OSR1與WNK3在其Thr233和Thr185兩個氨基酸位點結合，通過已磷酸化的WNK3 T環激活Spak/OSR1，活化的Spak/OSR1磷酸化NKCC1氨基末端多個蘇氨酸（Thr203/Thr207/Thr212），從 而 激 活NKCC1［31］。根據Gagnon和Delpire［32］在2010年的研究報告，蛋白磷酸酶參與NKCC1蛋白的去磷酸化，并進一步證實NKCC1的去磷酸化機制。晚近研究表明，與Spak結合的鈣結合蛋白39（Cab39）能夠激活NKCC1，注射編碼Cab39的cDNA可使Spak分子形成二聚體，從而激活NKCC1［33］。其他通過磷酸化調節NKCC1活性的因素包括環磷酸腺苷（cAMP）、環磷酸鳥苷（cGMP）、鈣離子等第二信使［19］，但在不同物種、組織中其影響有所不同［5］，第二信使通過與細胞內信號級聯的組織特異性中間體相互作用，而并非與離子本身相互作用而影響NKCC1的活性表達。

三、NKCC1與神經系統疾病

研究表明，在組織器官損傷過程中均有NKCC1的異常表達，且參與多種疾病的病理生理學機制，例 如急性肺 損傷［16］、肝 性腦病［17］、鉛中毒［23］等，尤其是腦卒中、癲 、膠質細胞瘤或精神分裂癥等中樞神經系統疾病與其關系密切相關。

1.NKCC1與腦卒中 離子穩態失衡是腦缺血誘導細胞損傷的重要機制，而陽離子?氯化物協同轉運蛋白不僅在神經元氯離子穩態調節中發揮作用，而且對維持血?腦屏障通透性、星形膠質細胞和神經元細胞內正常離子濃度，以及細胞容積同樣至關重要［34］。缺血性腦損傷發生后，細胞外鉀離子濃度升高，大量谷氨酸自細胞內釋放，胞內鈣、鈉、氯離子濃度超負荷；此時，雖然腦組織缺血?缺氧引起的能量代謝障礙可使Na+?K+?ATP酶分泌受抑制，但NKCC1仍可通過表達增加和活性增強進一步介導鈉離子內流，使細胞內滲透壓增高，由于細胞外水分向細胞內轉移導致細胞水腫［35］，而且血?腦屏障上的NKCC1過表達使腦組織進一步攝取水分，腦水腫加劇，患者可因顱內高壓而誘發腦疝并危及生命。付學軍等［36］通過對大腦中動脈閉塞大鼠模型的觀察發現，缺血?缺氧中心區星形膠質細胞的死亡方式主要以破碎為主，所見腫脹、核溶解等表現與脹亡的形態學變化相吻合，提示NKCC1導致的細胞水腫與缺血?缺氧中心區星形膠質細胞脹亡密切相關，而神經膠質細胞及血管內皮細胞腫脹可導致細胞間緊密連接破壞，進而破壞血?腦屏障，加重腦水腫［37］。此外，NKCC1導致的細胞內鈉離子聚積可迅速激活Na+/Ca2+交換蛋白的反向轉運，使鈣離子大量進入細胞內，細胞內鈣離子超載，繼而引起細胞損傷［38］。此外，腦卒中后的炎癥反應也可促進NKCC1的表達［27］，加劇細胞損傷。晚近研究表明，新型NKCC1抑制劑STS666對縮小腦梗死體積、保護神經元具有明顯療效［22］，因此NKCC1可能成為治療急性缺血性卒中的重要靶點。Zeniya等［39］認為，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）具有促進Spak和NKCC1磷酸化的作用，這可能是NKCC1在缺血性卒中合并高血壓患者腦組織中呈高表達的原因之一，因此對于缺血性卒中合并高血壓的患者，以NKCC1為靶點可能療效更佳。有研究顯示，NKCC1亦可作為缺血性卒中后抑郁的治療靶點，呈高表達的白細胞介素?18（IL?18）可通過IL?18受體/NKCC1信號轉導通路引起卒中后抑郁，若以IL?18及其下游的NKCC1作為靶點，可能是預防和治療缺血性卒中后抑郁頗具前景的策略［40］，但相關機制尚待深入研究。

3.NKCC1與膠質細胞瘤 膠質母細胞瘤（GBM）是中樞神經系統最為常見亦是最具侵襲性的原發性腫瘤，其對腦組織具有極強的侵襲性和浸潤性。研究證實，在膠質母細胞瘤細胞的遷移過程中，為了便于在腦組織中“穿行”可通過離子轉運而不斷調節其體積大小，NKCC1則可通過氯離子轉運快速調節腫瘤細胞的這種體積變化［28］。NKCC1在膠質母細胞瘤中呈高表達，NKCC1抑制劑可降低腫瘤細胞的擴散能力［8］。上皮間質轉化（EMT）可使上皮細胞的細胞極性和細胞黏附功能消失，使上皮細胞獲得遷移能力，提示上皮間質轉化是腫瘤轉移的關鍵步驟［46］。晚近研究發現，ras相關蛋白Rac1和轉化蛋白RhoA通路在上皮間質轉化進程中發揮關鍵作用，NKCC1通過Rac1和RhoA信號轉導通路調控膠質母細胞瘤上皮間質轉化過程［47］，從而促進腫瘤細胞的遷移。抗腫瘤藥物實驗發現，替莫唑胺可降低腫瘤細胞中鉀離子和氯離子濃度，使腫瘤細胞體積縮小并誘導其凋亡，同時可激活WNK?NKCC1通路；NKCC1特異性抑制劑布美他尼可使細胞內鉀離子和氯離子丟失加劇，促進腫瘤細胞凋亡［48］。總之，NKCC1可通過調節細胞體積，以及Rac1和RhoA信號轉導通路參與膠質母細胞瘤的侵襲過程，抑制NKCC1表達，促進腫瘤細胞凋亡［49?50］，因此針對膠質母細胞瘤侵襲能力的治療，以NKCC1作為靶點具有可行性。

4.NKCC1與精神分裂癥 精神分裂癥是一類重型精神病，其發病機制尚不十分清楚，通常認為與神經遞質代謝紊亂有關，尤其是前額葉皮質GABA代謝異常可能與精神分裂癥的神經功能障礙有關［51］。有研究顯示，精神分裂癥患者海馬KCC2 mRNA表達下調、NKCC1/KCC2比值增加，從而影響GABA的分泌與代謝，引起神經功能障礙［52］。Spak是NKCC1發生磷酸化并被激活的“催化劑”，Spak基因敲除增強了精神分裂癥模型小鼠的探索能力，而且大腦KCC2表達水平顯著升高，提示改變NKCC1/KCC2比值可能改善小鼠精神分裂癥相關癥狀［53］。研究發現，精神分裂癥患者腦組織中的NKCC1隨著WNK3和OSR1 mRNA表達的上調而升高，使GABA介導的細胞電位改變，參與精神分裂癥的發生與發展［54］。推測NKCC1和KCC2可能是調節GABA能信號的關鍵環節，但是否參與神經分裂癥的發病，有待進一步深入研究。

綜上所述，作為重要的離子轉運體，NKCC1表達變化受DNA甲基化和蛋白質磷酸化等多種因素的調節，通過對NKCC1的研究增進了對氯離子穩態調節的理解。NKCC1通過調節GABA能信號轉導和細胞體積參與多種生理活動和神經系統疾病過程，因此以NKCC1為治療靶點具有重要研究意義及應用價值。

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