距骨骨軟骨損傷MR T2-mapping與軟骨基質金屬蛋白酶-1表達的相關性研究

李偉，于澤晨，賈巖波，于靜紅*，海玲，烏日汗，白心雨

自18 世紀30 年代以來，先后有學者報道或提出了距骨剝脫性骨軟骨炎、距骨骨軟骨骨折、距骨骨軟骨病等概念，上述疾病在臨床、影像學表現以及相應治療方案很難完全區分開來，因此，醫療界將上述疾病統稱為距骨骨軟骨損傷(osteochondral lesions of the talus，OLT)[1]。OLT 主要累及距骨軟骨及相應水平的軟骨下骨，其損傷機制至今尚未完全明確[2]。近年來，國內外學者將目光聚焦在了蛋白水解酶家族(matrix metalloproteinase，MMPs)，其能夠水解所有細胞外基質。基質金屬蛋白酶-1 (matrix metalloproteinase-1，MMP-1)是一種膠原酶，其裂解關節軟骨Ⅱ型膠原能力最強，而Ⅱ型膠原正是關節軟骨細胞外基質主要成分之一。眾多學者研究表明，關節軟骨損傷可導致軟骨MMP-1 含量升高，進而打破MMPs-TIMPs 二者的平衡，進一步加重軟骨損傷[3-5]。關節鏡探查，一直以來都是OLT 診斷的金標準，但因其有創性這一因素，單純診斷性探查患者接受程度較差。磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)已成為臨床醫師診斷OLT 的最佳影像學檢查。MRI 自應用于關節軟骨評價以來，因其無創性、多維度(生理、生化、組織學、力學)評價關節軟骨而廣受臨床醫師關注，特別是功能MRI 的逐步開發、序列的優化，如T2-mapping成像，現已廣泛應用于科研、臨床對關節軟骨早期損傷、退變的診斷中[6]。

目前OLT 磁共振T2-mapping 功能成像與軟骨損傷MMP-1的表達之間的關系國內外報道鮮有提及，筆者通過對健康志愿者正常距骨軟骨和OLT 患者退變軟骨T2 值的測量、對OLT 患者術后離體軟骨行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)和蛋白免疫印跡實驗(Western Blot，WB)檢測距骨軟骨MMP-1 的表達，前瞻性探討OLT 患者磁共振T2-mapping 成像T2 值與關節軟骨MMP-1 蛋白表達的相關性，以其為臨床治療早、中期OLT 提供影像學定量參考信息。

1 材料與方法

1.1 研究對象

前瞻性研究：選取我院2018 年1 月至2020 年9 月間臨床診斷OLT 擬行關節鏡手術患者30 例。右踝關節19 例，左踝關節11 例，男性18 例，女性12 例，平均年齡(32.9±4.7)歲。所有患者及志愿者均簽署知情同意書，本研究經我校倫理委員會批準(批準文號：YKD201802235)。納入標準：(1)臨床資料完整，年齡：18～45 歲，性別不限；(2)以踝關節疼痛為主訴的患者；(3)術前均行MRI 檢查；(4)符合關節鏡及磁共振OLT診斷標準的患者。排除標準：(1)多發距骨骨軟骨損傷(3 處及以上，含3 處)；(2)繼發滑膜炎(痛風、類風濕等)；(3)確診為踝關節骨性關節炎(osteoarthritis，OA) (參照2018 中國版OA 診療指南)；(4)踝關節感染性病變；(5)大量關節積液；(6)踝關節手術史。

招募健康志愿者30名。按照性別分為兩組，男女組各15名。平均年齡(31.1±3.9)歲。納入標準：(1)既往體健，無高強度運動訓練史，常態生活；(2)自愿參加本次研究；(3)體重指數(body mass index，BMI)在18.5～23.9 kg/m2之間；(4)踝關節MRI 表現軟骨正常。排除標準：(1)既往有踝關節外傷史、感染史、手術史；(2)確診踝關節OA；(3)確診踝關節距骨骨軟骨損傷；(4)繼發滑膜炎。

1.2 儀器、檢查方法

1.2.1 MRI檢查設備

踝關節掃描儀器設備選用德國Siemens skyra 3.0 T 高場MRI，掃描線圈選用16 通道足踝專用線圈Foot/Ankle 16 A3T Tim coil。圖像后處理站為Syngo VIA VB10。

1.2.2 檢查方法

常 規 檢 查：SE T1WI (TR 750 ms，TE 15 ms)、fs-FSE T2WI (TR 2000 ms，TE 50 ms)：FOV 160 mm×160 mm，層厚3.0 mm，間距0.3 mm，矩陣320×320，NEX為4。

T2-mapping 功能成像采用多回波SE 序列，FOV 160 mm×160 mm，TR 1000 ms，TE 13.8、27.6、41.4、55.2、69.0 ms，矩陣320×320，層厚3.0 mm，間距0.6 mm，翻轉角180°，掃描時間2 min 24 s。

1.3 圖像分析

1.3.1 MRI分型

采用Hepple 改良分型(表1)，即Ⅰ型：單純關節軟骨損傷；Ⅱ型：以軟骨損傷、軟骨下骨骨折合并與否骨髓水腫分為ⅡA、ⅡB 兩型；Ⅲ型：損傷軟骨分離無移位；Ⅳ型：損傷軟骨分離有移位；Ⅴ型：合并軟骨下骨囊腫。

表1 OLT分型Tab.1 OLT parting

1.3.2 數據測量、分析

(1)健康對照組距骨軟骨分區及數據測量，根據磁共振矢狀位成像，距骨前、中、后部對應距骨滑車曲面前1/3、中1/3、后1/3。(2)據MR 冠狀位成像，距骨內、外側部對應距骨滑車各1/2。(3)根據上述(1)、(2)將距骨軟骨6 分區，即內前、內中、內后部，外前、外中、外后部，每分區隨機測量3個T2值(后處理站感興趣區放大測量)，ROI＞1.00 mm2，共計測量18 個T2值。

OLT 組距骨損傷區數據測量：據磁共振矢狀位成像、T2-mapping 偽彩圖、后處理融合圖，選取軟骨損傷中心區著色為綠色、黃綠色的區域(非深藍色、藍色區)，將上述區域等分為4 分區并編號標記，每個分區隨機選取ROI 測量1 個T2 值(后處理站感興趣 區 放 大 測 量)，ROI＞1.00 mm2，30 例 患 者 共 計120 個T2 值，測量ROI 時注意盡量避免選取鄰近分區分界部位。

健康對照組及OLT 組軟骨T2 值測量均由3 名副主任醫師及以上級別醫師獨立完成，當測量結果出現不一致時，經測量醫師共同協商得出一致結論。

1.4 HE染色、Western Blot檢測

1.4.1 觀察、標記

運動醫學外科醫師將關節鏡下微創手術取下的OLT 患者踝關節距骨軟骨損傷部分(包含距骨軟骨及相應軟骨下骨)現場做相應編號標記(標記術后取出的軟骨具體部位)。肉眼觀察距骨軟骨病灶中心區域以及術后取下的病灶中心附帶周圍區域的軟骨形態、損傷程度，并做好相應記錄。

1.4.2 分組、檢測

將醫師關節鏡下取出的損傷軟骨按編號及術后現場記錄軟骨具體部位，術后軟骨等分為4 等份，等分原則：與OLT患者術前MRI病灶軟骨4分區順序、大小相對應(剔除肉眼觀察已完全無軟骨附著或大部分無軟骨附著患者)。行HE 染色、Western Blot 檢測。HE檢測結果參照Mankin改良分級，依據軟骨結構、染色、細胞含量、潮線完整性進行評分。Ⅰ級：0～2 分；Ⅱ級：3～7 分；Ⅲ級：8～11 分；Ⅳ級：12～14 分。由3 名病理診斷醫師分別做出診斷，當軟骨分級結果出現不一致時，由分級醫師共同協商得出一致結論。Western Blot檢測采用Image-J軟件進行圖像分析。

1.5 統計學方法

采用Graphpad Prism 8.0.2 軟件對實驗中檢測的數據進行統計分析，數據滿足正態齊性和方差齊性時運用單因素方差分析，采用Pearson相關分析對軟骨MMP-1 表達與軟骨T2 值進行相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 健康對照組分區T2值

本組30 名健康志愿者距骨內側平均T2 值(內側前、中、后部)為(29.15±2.89) ms，與OLT組退變軟骨各級別兩兩比較T2 值(表2)差異有統計學意義(P＜0.05)；30 名健康志愿者距骨外側平均T2 值(外側前、中、后部)為(29.76±3.18) ms，與OLT 組退變軟骨各級別兩兩比較T2 值(表2)差異有統計學意義(P＜0.05)。

表2 距骨骨軟骨損傷區T2值與Mankin分級對照表Tab.2 Cartilage lesions of the talus area T2 values with Mankin classification table

2.2 OLT分型

本組30例患者MRI檢查共發現32處距骨骨軟骨損傷(2 例患者均有2 處病灶)。根據Hepple's MRI 分型：Ⅰ型2 例，Ⅱ型10 例，Ⅲ型5 例，Ⅳ型2 例，Ⅴ型11 例(表1)。據磁共振6 分區法，全部32 個病灶中有23個病灶部位位于內側中部。

2.3 OLT的MRI表現

健康志愿者，男，31 歲，踝關節磁共振T2 脂肪抑制圖與T2-mapping 偽彩圖(圖1A～C)。T2 脂肪抑制圖示軟骨分層較清晰，連續性良好。融合彩圖見踝關節距骨骨軟骨呈均勻深藍色色帶(融合彩圖左側色階顯示：深藍-深紅，由下到上，漸進，0-100)。

OLT 患者，男，36 歲，距骨骨軟骨損傷Ⅴ型：合并距骨軟骨下骨囊腫。踝關節磁共振T2脂肪抑制圖與T2-mapping 偽彩圖(圖2A～D)。T2 脂肪抑制圖示軟骨連續性中斷，局部軟骨厚度變薄，軟骨層側分界欠清晰。融合彩圖見踝關節距骨骨軟骨大部分區域呈黃綠色色帶(融合彩圖左側色階顯示：深藍-深紅，由下到上，漸進，0-100)。

2.4 OLT 患者距骨軟骨T2-mapping 與病理Mankin 分級對照

對30 例OLT 患者術后軟骨共計120 個區域進行采片，病理結果見表2。T2 值與病理分級對照可見，軟骨退變Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級相比較，T2 值隨軟骨退變病理分級程度的增高而呈上升趨勢，差異具有統計學意義(P＜0.05)；軟骨退變高級別與低級別相比較，T2值差異具有統計學意義(圖3A～D)(P＜0.05)。

2.5 OLT 患者距骨軟骨MMP-1 表達與病理Mankin 分級對照、與磁共振T2值相關性分析

踝關節距骨軟骨MMP-1的表達量隨ManKin分級明顯增大(圖4A)，Western Blot檢測MMP-1顯示(圖4B)，OLT 中MMP-1 在軟骨中的表達隨著軟骨ManKin 分級呈明顯增大的趨勢，且隨著級別增高，蛋白表達明顯增加(圖4C)。

圖4 A：距骨骨軟骨MMP-1表達Mankin分級比較直條圖；B：距骨骨軟骨MMP-1蛋白表達圖(western Blot)；C：距骨骨軟骨MMP-1表達與T2值相關性分析圖Fig. 4 A: Mankin grading comparison straight bar chart of MMP-1 expression in talus osteochondral. B: Expression of MMP-1 of talus osteochondral (western Blot).C:Correlation analysis of MMP-1 expression and T2 value in talus osteochondral.

3 討論

3.1 病因、流行病學、發病機制

OLT 多發生于20～40 歲間的中、青年人，男多于女，其發病機制尚未明確，目前認為其發病原因多是外傷導致，本研究30 例患者中28 例有明確外傷史，全部30 例OLT 患者中有23 例發病部位在內側中部，這與國內學者研究略有出入[7]。從踝關節生物力學機制分析OLT內側損傷居多的原因，可能為以距腓前韌帶、跟腓韌帶為主的外側韌帶損傷、松弛導致內側距骨應力顯著增大引起[8]。

研究表明，炎癥因子及其相關機制導致了軟骨損傷、退變的發生、發展。這其中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)受到國內外學者的持續關注。MMPs 是酶活性依賴鋅離子的蛋白酶超家族，具有極強的同源性，在正常穩定狀態的軟骨組織中很少表達，但當軟骨損傷、退變等因素激活軟骨相關炎性機制時，MMPs 的表達顯著增多。而MMPs在OLT 軟骨細胞外基質合成與降解失衡導致軟骨變性這一機制中起決定性作用。國內外學者在與軟骨相關的MMPs 領域研究較多是MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-13。研究報道，MMP-1 對Ⅱ型膠原的裂解作用較強，MMPs家族成員對Ⅱ型膠原的降解需依賴MMP-1的協同作用來發揮效應。有研究顯示MMP-1 在關節軟骨損傷、退變中表達顯著增高，且軟骨損傷、退變程度與MMP-1 的增高表達呈正相關[9-14]。本研究結果表明，距骨骨軟骨T2 值隨軟骨損傷Mankin 分級逐級增大，MMP-1 蛋白表達隨軟骨Mankin 分級顯著增加，高級別與低級別差異明顯(圖4A)。MMP-1 在OLT 軟骨中含量的表達變化可以作為重要的量化參數來指導臨床評估和治療OLT 特別是早期OLT 病變的提示及預防。

3.2 MRI表現、分型

雖然關節鏡是OLT診斷的金標準，但其因探查盲區，有創等因素，單純的診斷性關節鏡探查，患者接受度相對MRI 較差。MRI 因其固有的優越性，可精確顯示OLT病灶的大小以及病灶的位置，在距骨骨軟骨損傷術前評估、手術方案制定以及術后復查中都發揮著不可替代的輔助作用。有學者研究表明，60%以上的OLT 患者病損位置居于距骨內側[15]。本研究中30 例OLT 患者共計32 個病灶(2 例有2 處病灶)，其中23 個位于距骨內側中部(71.9%)，這與上述研究結果基本一致。

距骨骨軟骨損傷MRI的Hepple 改良分型重點補充了軟骨下囊腫形成這一概念。MRI 對距骨骨軟骨損傷合并軟骨下囊腫(Ⅴ型)顯示優良，很好地解決了關節鏡難以顯示深部軟骨、軟骨下骨的困擾。臨床醫師可以依據Hepple Ⅴ型的MRI表現判斷病灶的大小及位置，輔助臨床手術方案的制定。本研究全部30 例患者中11 例屬于Hepple Ⅴ型患者，總站比達36.7%，11 例Ⅴ型患者中9 例患者病灶位于內側中部(81.8%)，這與史尉利等[16]的研究略有出入，分析原因可能與本研究入選患者數較少有關。

3.3 T2-mapping

OLT 是踝關節損傷最常見的疾病之一，其早發現早治療非常關鍵。MRI 因其無創、敏感的特性成為臨床醫師輔助診斷OLT 的首選。這其中MRI 功能成像之一的T2-mapping 很好的彌補了MRI 常規序列對關節軟骨本身顯示的不足，但是其診斷價值、診斷標準意見尚未統一，其掃描時間過長、對掃描機型要求較高等因素明顯制約其實用性。本組患者在保證掃描圖像質量的前提下，T2-mapping 單個序列優化后掃描時間均控制在2 min 30 s 以內，掃描時間的縮短顯著提高了受檢者的接受度及T2-mapping成像的實用性[17]。

T2-mapping通過T2弛豫時間這一參數值來顯示軟骨內部T2 值，關節軟骨的T2 值取決于膠原含量、排列方向及軟骨內水的含量，有學者研究表明，關節軟骨損傷、退變的T2 值均較正常軟骨為高，而且T2 值隨關節軟骨退變的嚴重程度增加而升高。關節軟骨由淺到深的分層結構的生化特性決定了其T2值范圍區間的特性，進而決定其T2-mapping 后處理融合圖像能夠良好地依靠圖像偽彩的不同來顯示軟骨相應層次結構。本研究所有30例患者的T2-mapping融合圖像均能良好地顯示距骨軟骨正常區、病灶區，通過偽彩圖顏色的變化即可初步、直觀地判斷軟骨損傷與否及損傷程度，通過對T2值的測量分析，可客觀、定量分析距骨軟骨損傷，二者有機結合可為臨床醫師診治OLT 提供影像學客觀依據(圖1A～C，圖2A～D)。

踝關節距骨骨軟骨損傷時，軟骨生化成分的改變出現在軟骨發生形態改變之前，這種改變可通過軟骨T2 值反映出來。研究表明，軟骨損傷早期(Ⅰ、Ⅱ級)，水分進入松散的軟骨架構，軟骨T2 值升高，大部分學者認為此時的關節軟骨尚具備自我修復的能力。軟骨損傷中、末期，隨著軟骨細胞數量、軟骨水分含量驟降，Ⅱ型膠原纖維的含量降低等因素，導致關節軟骨自我修復能力喪失殆盡，關節軟骨T2 值雖有增高但不顯著。本組患者中距骨軟骨損傷級別較高的患者軟骨T2 值增高仍舊有統計學意義(表2)，分析其中原因，可能是國內外學者大部分關節軟骨、損傷退變的研究數據都是基于膝關節OA 得來，而膝關節OA 病程較OLT 患者病程明顯為長，OLT 軟骨水分丟失較膝關節OA 相對較少，高級別OLT 損傷軟骨T2 值增高仍較明顯。

T2-mapping可以通過軟骨T2弛豫時間來定量檢測關節軟骨內組織成分的變化，國內有學者研究認為膝關節骨性關節炎軟骨的退變程度與軟骨MMP-1 的表達量呈正相關[18]，這一結論預期可為臨床早期診斷、監測退變的關節軟骨靶向治療效果提供客觀依據。OLT 軟骨退變機理與膝關節骨性關節炎關節軟骨退變的機理有眾多相似之處，踝關節距骨軟骨損傷伴隨著關節滑膜及軟骨細胞內MMP-1 表達升高，MMP-1 在OLT 患者軟骨損傷的病理進程中起關鍵性作用。調節、阻斷MMP-1及其相關信號通路的表達可以防治早中期踝關節距骨骨軟骨損傷，這一新的思路為研發治療早期OLT 的靶向治療藥物提供新途徑。本組30 例OLT 患者術后軟骨120 個區域T2 值隨軟骨病理分級程度的增高而呈上升趨勢(表2)。軟骨損傷級間比較、高級別與低級別相比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)，這與部分學者研究結果略有出入，分析其原因，可能是入組患者數較小、T2 值測量標準的差異等因素導致。

綜上所述，踝關節距骨骨軟骨損傷軟骨損傷、退變與MMP-1的表達具有一定的相關性，磁共振定量成像技術可以為關節軟骨損傷以及早期退變評估提供新的手段[19-22]，但國內外學者研究主體多為動物模型的初步階段，還需要更多的臨床研究數據佐證。本研究亦有局限性，如患者數較少，病理取材相對難度較大，踝關節距骨軟骨正常T2值尚未有統一標準等，這些潛在的影響因素可能會對實驗結果產生一定的干擾。

本研究用優化參數后的T2-mapping對臨床診斷OLT 行關節鏡手術者進行掃描并定量分析，顯著提高了T2-mapping 在OLT 定量診斷的實用性，同時對手術切除軟骨進行HE 染色觀察軟骨病理組織學改變，探索OLT 患者關節軟骨MMP-1 的表達信息，研究OLT軟骨損傷、退變的分子、基因病理基礎，為OLT 的MRI定量分析、診斷及病情監測提供客觀理論依據，以期提高OLT早、中期診療水平。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。