鈣非依賴型磷脂酶A2介導心肌缺血再灌注損傷

黃漫枝，蔡文鋒，石剛剛

（汕頭大學醫學院藥理學教研室，廣東 汕頭 515041）

缺血性心肌病是危害我國國民健康的重大疾病之一，及時溶栓或經皮冠脈介入術等方法進行再灌注是挽救缺血心臟的必需步驟，但該過程常伴隨著嚴重的心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)，至今仍缺乏有效的干預手段。MIRI是一個復雜、多因子參與的病理過程，其病理機制目前尚不明確，可能與鈣超載、氧化應激、能量代謝以及炎癥反應等有關。

磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)是具有甘油磷脂水解活性的一大類家族酶，其可在甘油磷脂的sn-2位置水解?；I，產生游離脂肪酸和溶血磷脂[1]。PLA2大致可分為：分泌型PLA2、胞質型PLA2、不依賴 Ca2+的 PLA2(Ca2+-independent PLA2，iPLA2)和血小板活化因子乙酰水解酶四大類。iPLA2可水解膜磷脂生成花生四烯酸和溶血磷脂酰膽堿[2-3]?；ㄉ南┧峥梢栽谠俟嘧㈦A段促進炎癥反應[4]，而溶血磷脂酰膽堿被認為有致心律失常的作用[5]，造成心肌細胞鈣離子超載，影響心臟的機械與代謝活動。有文獻[6]報道，在缺血心肌中iPLA2對縮醛磷脂的活性增加了10倍，缺血5 min后iPLA2活性達到最高并持續了1 h。我們前期在離體實驗中發現心肌細胞缺氧再復氧過程中，心肌細胞轉染iPLA2質粒使iPLA2高表達后的缺氧再復氧損傷加重；轉染iPLA2-siRNA沉默iPLA2基因，缺氧再復氧損傷減輕，表明iPLA2參與心肌細胞的缺氧再復氧損傷[7]。本研究擬在整體心肌缺血再灌注模型上探討iPLA2表達的時效性，并借助于iPLA2基因敲除方法，確證iPLA2與MIRI的因果關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6JNifdc小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，iPLA2-/-的C57BL/6JNifdc小鼠由賽業(蘇州)生物科技有限公司構建，飼養于汕頭大學醫學院實驗動物中心，由本課題組成員飼養繁殖并鑒定基因型。本研究經汕頭大學醫學院實驗動物倫理委員會審查批準。

1.1.2 主要試劑和儀器 戊巴比妥鈉購自德國Merck公司；iPLA2兔多克隆抗體購自美國Cayman公司；Tubulin鼠多克隆抗體購自北京中杉金橋公司；CD68小鼠多克隆抗體購自英國Abcam公司；HRP標記山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG、Cy3標記山羊抗小鼠IgG(H+L)購自上海碧云天公司。小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)；Vevo LAZR小動物多模成像系統(加拿大Fujifilm VisualSonics公司)；CM1850冰凍切片機(德國Leica公司)；TBA-40FR全自動生化分析儀(日本Toshiba公司)；Olympus BX53正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠基因型鑒定 將小鼠作好標記后采集小鼠鼠尾，保存于EP管中，按DNA提取試劑盒提取總DNA，PCR反應體系如下：94℃3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環；72℃10 min。取10 μL上樣，用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，40 min后觀察DNA條帶。

1.2.2 小鼠心肌缺血再灌注模型的建立 8～10周齡的小鼠禁食12 h后稱重，腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(60 mg/kg)進行麻醉。將小鼠通過氣管插管連接呼吸機，呼吸頻率115，呼吸比1.3∶1，潮氣量2.0。在小鼠第3和第4肋骨間開胸暴露心臟，撕開心包膜后明顯觀察到左心耳位置。使用8-0的帶針縫線結扎左前降支，造成心肌缺血。缺血結束后松開結扎線，進行相應時間的再灌注，建立心肌缺血再灌注模型。

1.2.3 實驗分組 采用隨機數字表法隨機分組。(1)C57BL/6JNifdc小鼠隨機分成5組：假手術組(sham組)、不同時間缺血組(15、30、45、60 min)，每組各6只。(2)C57BL/6JNifdc小鼠隨機分成8組：sham組、缺血45 min后不同時間再灌注組(0.5、1、2、3、4、5、6 h)，每組各6只。(3)野生型C57BL/6JNifdc小鼠和iPLA2-/-C57BL/6JNifdc小鼠隨機各分為2組：sham組和缺血45 min再灌注3 h組，每組各6只。

1.2.4 免疫熒光法觀察CD68的表達 將小鼠心臟置于冰上，制作厚度8 μm冰凍切片，于冰上用4%多聚甲醛中固定15 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min，用免疫熒光封閉液室溫封閉1 h。滴加50 μL 稀釋后的CD68抗體(V抗體∶V封閉液=1∶50)，于4℃孵育過夜。第2天常溫下復溫30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min。以下步驟都需避光。滴加50 μL稀釋后的Cy3標記山羊抗小鼠IgG熒光二抗(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min，DAPI染核5 min，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min，滴加抗熒光猝滅封片液，于熒光顯微鏡下觀察結果。通過計算每組中CD68陽性表達細胞數所占的比例進行統計分析。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測iPLA2蛋白的表達水平 提取小鼠心肌組織蛋白：按100 mg心肌組織加1 mL蛋白裂解液的比例加入預冷的蛋白裂解液，用乳化分散儀進行組織勻漿，冰上靜置30 min，4℃12 000 r/min離心15 min后收集上清液。BCA法進行蛋白定量后按4∶1的比例加入5倍上樣緩沖液，煮沸5 min變性；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(50 V)至分離膠后，更換100 V電壓繼續電泳1 h；電轉膜法將蛋白轉移到硝酸纖維素膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h；ECL化學發光后曝光；Gel-Pro圖像分析軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.2.6 全自動生化分析儀檢測小鼠血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶的活性 將小鼠血清用生理鹽水分別稀釋64倍、16倍、16倍，每個稀釋后的樣本吸取100 μL于檢測管，用TBA-40FR全自動生化分析儀測定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)、 肌 酸 激 酶 (creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB)活性。

1.3 統計學分析

應用SPSS 18.0統計軟件進行分析。計量資料經K-S正態性檢驗符合正態分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠心肌缺血再灌注時iPLA2蛋白表達的時效變化

與sham組相比，隨著缺血時間的延長，iPLA2的表達逐漸升高，且在缺血45 min時達到峰值，差異具有統計學意義(P＜0.05)，缺血60 min時iPLA2的表達較45 min略有下降，但差異無統計學意義(P＞0.05)，如圖1A所示。與sham組相比，當缺血時間固定為45 min時，隨著再灌注時間的延長，iPLA2蛋白的表達逐漸升高，再灌注3 h時達到峰值，差異具有統計學意義(P＜0.05)，再灌注4、5、6 h時iPLA2的表達較再灌注3 h略有下降，但差異無統計學意義(P＞0.05)，如圖1B所示。因此，選擇缺血45 min再灌注3 h作為后續研究模型制作的時間點。

圖1 小鼠心肌缺血再灌注時iPLA2蛋白表達的時效變化

2.2 iPLA2在小鼠MIRI中的作用

2.2.1 iPLA2基因敲除小鼠的鑒定 iPLA2基因敲除小鼠的構建方法是敲除iPLA2所在PLA2G6基因的2 817 bp。如圖2所示，雜合子小鼠顯示出526 bp和573 bp兩個條帶，純合子小鼠即iPLA2基因敲除鼠僅有526 bp條帶，而野生型小鼠僅有573 bp條帶。純合子小鼠和野生型小鼠用于后續實驗，雜合子小鼠予以剔除，不用于后續實驗。

圖2 iPLA2基因敲除小鼠的基因型鑒定

2.2.2 iPLA2基因敲除能改善心肌缺血再灌注后血清酶的漏出 野生型小鼠sham組與iPLA2-/-小鼠sham組相比血清酶活性差異無統計學意義(P＞0.05)；與野生型小鼠sham組相比，野生型小鼠在缺血再灌注后，CK、CK-MB和LDH的漏出增多，差異具有統計學意義(P＜0.05)；與野生型小鼠缺血再灌注組相比，iPLA2-/-小鼠缺血再灌注后CK、CK-MB和LDH的漏出減少，差異具有統計學意義(P＜0.05)，如圖3。

圖3 iPLA2基因敲除改善心肌缺血再灌注后血清酶的漏出

2.2.3 iPLA2基因敲除能改善MIRI中的炎癥反應 如圖4所示，圖中的藍色熒光代表細胞核，紅色熒光代表CD68陽性細胞，通過計算CD68陽性表達的細胞數所占的比例來評價組織中巨噬細胞的多少。野生型小鼠sham組與iPLA2-/-小鼠sham組相比差異無統計學意義；與野生型小鼠sham組相比，野生型小鼠心肌缺血再灌注后，心肌組織中CD68標記的炎癥細胞增加，差異具有統計學意義(P＜0.05)；與野生型小鼠心肌缺血再灌注組相比，iPLA2-/-小鼠心肌缺血再灌注后心肌組織中CD68標記的炎癥細胞表達減少，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

圖4 iPLA2基因敲除對心肌缺血再灌注后CD68表達的影響

3 討論

本研究顯示在小鼠MIRI中，iPLA2的表達上調，其表達的峰度與缺血或再灌注時間密切相關。這與本課題組前期對于細胞水平的研究結果是一致的[8]?；罨膇PLA2可以水解肌膜磷脂造成脂肪酸在細胞膜上的積累和溶血磷脂酰膽堿的釋放增加。這兩種產物具有多種效應，介導不同信號通路而產生不利于損傷恢復的反應，通過參與離子通道的調節對一系列炎癥、凋亡等反應產生作用，尤其在MIRI中發揮重要作用。Mancuso等[9]采用Langendorff方法制作缺血模型，發現過表達iPLA2小鼠在缺血幾分鐘內即可發生惡性室性快速心律失常，給予iPLA2抑制劑后的轉基因小鼠發生惡性室性快速心律失常的概率降低。Moon等[10]的研究表明，與野生型小鼠比較，iPLA2γ敲除小鼠在心肌缺血再灌注模型中，其梗死面積明顯減少。由此我們合理地推測iPLA2不但是心肌缺血還是再灌注損傷中的重要因子。本研究借助于iPLA2基因敲除小鼠，以心肌損傷的幾個標志性血清酶為參數，證明了iPLA2蛋白的高表達是MIRI的重要原因。

CD68所標記的炎癥細胞代表組織中的巨噬細胞，巨噬細胞在免疫反應中扮演了很重要的角色，其對細胞殘片及病原體進行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴細胞或其他免疫細胞，參與到免疫反應中。本研究中iPLA2-/-小鼠MIRI中的炎癥反應與野生型小鼠比較得到明顯改善，表現為CD68標記的炎癥細胞表達減少。這可能與iPLA2的產物花生四烯酸可以在再灌注階段促進炎癥反應有關。炎癥反應是MIRI中主要病理現象之一，Nelson等[11]的研究用脂多糖刺激從野生型小鼠和iPLA2-/-小鼠分離的巨噬細胞，發現前列腺素E2在iPLA2-/-小鼠分離的巨噬細胞中表達減少，表明iPLA2影響了巨噬細胞的功能。而本研究則進一步發現，iPLA2還可以增加缺血區巨噬細胞的浸潤數量而加重炎癥反應。

綜上所述，本研究從整體水平上說明了敲除iPLA2基因后對小鼠MIRI具有保護作用，因此在MIRI中，具有選擇性和生物可利用性的iPLA2抑制劑可作為一種潛在的治療工具。