小麥葉綠素含量測(cè)定方法比較

努爾凱麥爾·木拉提 楊亞杰 帕爾哈提·阿布都克日木 瑪依努爾·吾斯曼

摘要：測(cè)定植物葉綠素含量有多種方法，以小麥為材料，在前人研究的基礎(chǔ)上，驗(yàn)證長(zhǎng)勢(shì)相近的小麥葉片在同等試驗(yàn)條件之下，比較測(cè)定葉綠素含量的6種方法。結(jié)果表明，原子吸收光譜法所測(cè)得的葉綠素含量最高且結(jié)果最準(zhǔn)確、可靠;浸提法所得的葉綠素含量也較高但時(shí)間過長(zhǎng);研磨法結(jié)果偏低且過程繁瑣;葉綠素儀法并不適合作為精確測(cè)量葉綠素含量的方法。所測(cè)葉綠素含量從高到低依次為原子吸收光譜法>無水乙醇浸提法>80%乙醇浸泡法>95%乙醇研磨-過濾法>95%乙醇研磨-離心法>葉綠素儀法。此結(jié)論可為其他研究者提供一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞：小麥;葉綠素;原子吸收光譜法;浸泡法;研磨法

中圖分類號(hào)： S512.101 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）09-0156-04

小麥（Triticum aestivum L.）是一種糧食作物，其產(chǎn)量的提高可以極大地推動(dòng)農(nóng)業(yè)發(fā)展。而影響小麥產(chǎn)量最重要的因素是其中的葉綠素含量，葉綠素含量常作為評(píng)定植物適應(yīng)環(huán)境能力和生長(zhǎng)狀況的一個(gè)重要項(xiàng)目[1]。因此小麥葉綠素含量測(cè)定的研究就顯得格外重要，其測(cè)定方法有很多，但是對(duì)各種方法的比較卻鮮見報(bào)道。針對(duì)這一現(xiàn)象，筆者所在課題組把各種方法進(jìn)行比較找出各自優(yōu)缺點(diǎn)，并在筆者所在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)方法的葉綠素含量測(cè)定。以期為他人選擇最適合的方法測(cè)定葉綠素含量提供參考，為合理試驗(yàn)、科研奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小麥種子的處理

取預(yù)先準(zhǔn)備好的小麥種子，從中選取顆粒飽滿的種子，自來水沖洗表面灰塵和雜質(zhì)后備用;用自來水將120 mm培養(yǎng)皿沖洗干凈，晾干，放上2～3張濾紙，用水打濕。將備用的小麥種子平鋪在濾紙上，放入4～5個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，放到陽光充足、溫度適宜的地方進(jìn)行培養(yǎng)，隔3～4 h澆1次水。觀察小麥生長(zhǎng)情況，待小麥苗長(zhǎng)至5 cm時(shí)移到花盆中進(jìn)行后續(xù)生長(zhǎng)，待小麥葉片蔥綠，高度約10 cm時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 95%乙醇研磨-過濾法 取新鮮干凈小麥葉片，稱量0.4 g于研缽中剪碎，加入少許石英砂和碳酸鈣粉及4～6 mL 95%乙醇，研磨成勻漿，繼續(xù)加入95%乙醇研磨至組織變?yōu)榘咨o置一段時(shí)間，取1張干凈濾紙放于漏斗內(nèi)壁，用乙醇潤(rùn)濕，玻璃棒置于濾紙3層處，把勻漿沿玻璃棒引流，過濾到 50 mL 棕色容量瓶中，用乙醇洗研缽及玻璃棒，一并轉(zhuǎn)入，最后用95%乙醇定容至50 mL，重復(fù)2次。

取潔凈比色皿（用手拿住比色皿的糙面），先用少量待測(cè)液清洗2～3次，然后將溶液倒入比色皿中（高度不得超過比色皿總高的4/5），將灑出的溶液用濾紙吸掉，第1個(gè)比色皿中放95%乙醇溶液為空白對(duì)照。然后測(cè)定其在波長(zhǎng)663 nm和645 nm處的吸光度。每個(gè)重復(fù)在不同波長(zhǎng)下測(cè)3次，取平均值。

1.2.2 95%乙醇研磨-離心法 取新鮮干凈小麥葉片，稱取0.5 g于研缽中剪碎，加入少許石英砂和碳酸鈣粉及3 mL 95%乙醇，研磨成勻漿，再加95%乙醇3～5 mL，靜置一段時(shí)間，將勻漿轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，并用適量95%乙醇洗滌研缽，一并轉(zhuǎn)入，然后以4 000 r/min離心10 min后，棄沉淀，上清液用95%乙醇定容至10 mL，重復(fù)2次。

取上述色素提取液2 mL，加95%乙醇16 mL稀釋得到待測(cè)液;測(cè)定與計(jì)算方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.3 無水乙醇浸提法 稱取新鮮干凈小麥葉片0.02 g，將其剪成長(zhǎng)度約5 mm、寬度約1 mm的細(xì)絲。將準(zhǔn)備好的細(xì)絲等量分別放入3支試管中（試管用黑塑料袋包裹），滴加10 mL無水乙醇，室溫下暗處浸泡提取3 d左右，期間加以搖晃可縮短浸泡時(shí)間，至小麥葉片無色或白色。

將提取液再次定容至10 mL;測(cè)定與計(jì)算方法同“1.2.1”節(jié)，其中空白對(duì)照為無水乙醇。

1.2.4 80%乙醇浸提法 步驟同“1.2.3”節(jié)，只需用80%乙醇溶液替代無水乙醇即可。

1.2.5 葉綠素儀法 手持CM-1000葉綠素測(cè)量?jī)x，距離小麥葉片30.5～183.0 cm，打開開關(guān)，即可進(jìn)行掃描，等數(shù)據(jù)出現(xiàn)后進(jìn)行記錄，間隔2 s就可以進(jìn)行下一次測(cè)量，重復(fù)3次取平均值。

1.2.6 原子吸收光譜法 鎂標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將配制好的1.000 mg/mL鎂儲(chǔ)備液稀釋至 10.00 μg/mL，得到鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液。移此溶液0、0.5、1.5、2.5、3.5、5.0 mL于6個(gè)50 mL的容量瓶中，再分別滴加20 mL 0.8 mol/mL HCl溶液，用蒸餾水定容。得濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液，以濃度為0的溶液作為空白對(duì)照，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液在285 nm處的吸光度，分別為0.015、0.116、0.245、0.418、0.552、0.743，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性函數(shù)為y=0.726 5x+0.033 3，見圖1。

取新鮮干凈小麥葉片，稱取約2.0 g剪碎，加入少許石英砂和碳酸鈣粉及4～6 mL無水乙醇，研磨成勻漿，繼續(xù)加入無水乙醇研磨至組織變?yōu)榘咨o置一段時(shí)間，取1張干凈濾紙放于漏斗內(nèi)壁，用乙醇潤(rùn)濕，玻璃棒置于濾紙3層處，把勻漿沿玻璃棒引流，過濾到50 mL棕色容量瓶中，用乙醇洗研缽及玻璃棒，一并轉(zhuǎn)入，最后用無水乙醇定容至50 mL，重復(fù)2次。得到小麥葉綠素提取液，置于避光處備用。

取上述葉綠素提取液4.0 mL于分液漏斗中，滴加4.0 mL石油醚，輕輕搖動(dòng);再加4.0 mL NaCl溶液，上下振蕩;再加入12.0 mL蒸餾水，充分振蕩以后靜置分層，深綠色的石油醚層在上層，水-乙醇層在下層。從下面倒出水-乙醇層，再用4.0 mL石油醚重復(fù)萃取2次，然后合并3次所得到的石油醚相。于其中加入20 mL 0.8 mol/L的HCl溶液，充分振蕩后放置分層，將水相轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得到待測(cè)液。

2 結(jié)果與分析

由表1可見，95%乙醇研磨-過濾法所測(cè)得的葉綠素含量高于95%乙醇研磨-離心法;無水乙醇浸提法所測(cè)得的葉綠素含量高于80%乙醇浸提法;浸提法所測(cè)得的葉綠素含量均高于研磨法;葉綠素儀法無法測(cè)出葉綠素a、葉綠素b含量。原子吸收光譜法測(cè)得的葉綠素總量為（4.025±0.110） mg/g，其所測(cè)得的葉綠素總量最高，且標(biāo)準(zhǔn)差也最小，所以此方法所測(cè)結(jié)果最準(zhǔn)確，但缺點(diǎn)是無法測(cè)出葉綠素a、葉綠素b的含量。

小麥葉片在經(jīng)過95%乙醇溶液研磨之后，過濾法與離心法測(cè)得的葉綠素含量有明顯差異。過濾法所測(cè)得的含量高于離心法，說明在離心的過程中，勻漿從研缽轉(zhuǎn)移到離心管以及葉綠素提取液從離心管轉(zhuǎn)移到試管的過程中，小麥葉綠素遭到光、氧的損傷，同時(shí)還存在溶液灑出的情況，導(dǎo)致離心法測(cè)得的含量偏低;而在過濾的過程中，并沒有頻繁的轉(zhuǎn)移過程，直接過濾定容到容量瓶即可，可避免葉綠素的損失。

乙醇作為提取劑來浸泡小麥葉片，不同濃度乙醇處理測(cè)得的葉綠素含量不同，可知提取劑濃度會(huì)影響葉綠素含量的測(cè)定。在相同條件之下，采用無水乙醇浸泡比80%乙醇浸泡測(cè)定效果更好，說明乙醇濃度越低其含水量越高，葉綠素在其提取劑中的溶解度降低，所以測(cè)得的葉綠素含量降低。

浸提法測(cè)得的數(shù)據(jù)均比研磨法高，說明浸提法對(duì)小麥葉片的損害較少。在研磨過程中，研磨時(shí)間過長(zhǎng)使葉綠素受到光解，且過程比較繁瑣，既要進(jìn)行研磨，還有后續(xù)的過濾或離心處理，葉綠素含量會(huì)發(fā)生一定的減少。而浸提法只需將小麥葉片剪成細(xì)絲狀就可以直接放入浸提液中反復(fù)浸泡，至葉絲變白或無色即可，過程較簡(jiǎn)單，且所測(cè)含量也較高。

葉綠素儀法測(cè)得的結(jié)果是最低的，因?yàn)樵跍y(cè)量過程中，CM-1000葉綠素儀所要求的待測(cè)植物的面積直徑最低應(yīng)為1.35 cm，而試驗(yàn)中所采用的小麥葉片由于生長(zhǎng)時(shí)間較短，寬度僅為0.2～0.4 cm;又因?yàn)槭褂萌~綠素儀測(cè)定時(shí)，小麥葉片呈現(xiàn)一定程度的發(fā)黃現(xiàn)象，導(dǎo)致最終結(jié)果偏低。說明此方法無法測(cè)出準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，但是它的整個(gè)試驗(yàn)過程極其簡(jiǎn)單，對(duì)待測(cè)樣品也沒有嚴(yán)格的處理要求，只需保持一定的距離進(jìn)行掃描即可得出葉綠素含量。

原子吸收光譜法所測(cè)得的葉綠素總量為 4.025 mg/g，為6種方法中測(cè)得含量的最高值，且準(zhǔn)確性也是最可靠的，因?yàn)橥ㄟ^間接測(cè)定葉綠素中鎂元素的濃度進(jìn)而測(cè)定葉綠素含量，在其過程中可以減少葉綠素的降解和損失問題。但試驗(yàn)過程中也存在一些誤差，比如葉綠素提取液的制備采用的是研磨法，存在一定程度的光解。但是與其他方法相比，此方法所用的火焰原子吸收光光度計(jì)能夠靈敏可靠地測(cè)定鎂元素的吸光度，所以其準(zhǔn)確性仍是最高，誤差也最小。

3 結(jié)論與討論

在測(cè)定小麥葉綠素含量的6種方法中，原子吸收光譜法雖不是直接測(cè)定葉綠素含量的方法，但是其測(cè)定過程是對(duì)葉綠素中鎂元素進(jìn)行直接測(cè)定，測(cè)定鎂元素的吸光度與直接測(cè)定葉綠素吸光度相比，其操作過程不存在葉綠素的降解，所以它的測(cè)定結(jié)果是最可靠、最準(zhǔn)確的。無水乙醇浸提法所得結(jié)果較準(zhǔn)確但時(shí)間最長(zhǎng);葉綠素儀法是粗略估計(jì)但時(shí)間最短;研磨法是傳統(tǒng)方法且一直沿用至今，但是過程繁瑣，需耗時(shí)耗力。另外，浸提法、研磨法以及原子吸收光譜法都是對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行離體檢測(cè)，在此過程中也存在對(duì)待測(cè)樣品不同程度的損傷，而葉綠素儀法則是活體檢測(cè)，無需采摘;同時(shí)葉綠素儀法和原子吸收光譜法只能測(cè)出小麥的葉綠素總量，無法測(cè)出葉綠素a、葉綠素b含量。

葉綠素含量是所有植物十分重要的生理指標(biāo)之一[2]，一直以來以傳統(tǒng)的研磨法應(yīng)用最為廣泛，深受各位研究者的青睞，本次研究也采用了研磨法，得知了其對(duì)葉綠素含量的影響，以及其他方法對(duì)含量測(cè)定的影響。

在研磨-過濾和研磨-離心2種方法的操作過程中，考慮到過濾法比較耗時(shí)和乙醇揮發(fā)較快的原因，所以同時(shí)做了離心試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，離心所測(cè)的含量比過濾法還要低。但總體來講，研磨法與其他方法相比，表現(xiàn)為步驟瑣碎、工作量大、在研磨過程中對(duì)小麥葉片易有損傷且很容易受光氧化分解，并且無法防止試驗(yàn)者不與揮發(fā)到四周空氣中的藥品接觸，對(duì)身體有較大的傷害[3]。所以，有人對(duì)此種方法進(jìn)行了改進(jìn)[4]，但是由于對(duì)待測(cè)樣品的提取不徹底、效率低以及提取劑不穩(wěn)定等因素而未被廣泛使用[5]。所以研磨法從嚴(yán)格意義上來說，其測(cè)量結(jié)果偏低，也比較麻煩，并不適宜用來測(cè)定葉綠素含量，但是它作為測(cè)量植物葉綠素含量的鼻祖，必將會(huì)一直沿用下去，并且對(duì)于教師的試驗(yàn)教學(xué)過程還是比較適宜的。

用浸提法來進(jìn)行小麥葉綠素含量測(cè)定時(shí)，使用了2種不同濃度的同一種提取劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度組所測(cè)的含量比較高且準(zhǔn)確。但這并不能說明提取劑濃度與所測(cè)葉綠素含量表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，如果未來有機(jī)會(huì)，將會(huì)使用乙醇作為單一提取劑，作梯度濃度試驗(yàn)，以確定最佳乙醇濃度。同時(shí)本試驗(yàn)與洪法水等的丙酮乙醇混合液作為浸泡液的試驗(yàn)[6]作比較，發(fā)現(xiàn)其效果相對(duì)偏低;與王文杰等的二甲基亞砜法浸泡提取葉片葉綠素相比[7]，其時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。但是浸提法所測(cè)得的含量在6種方法當(dāng)中也是明顯較高的，且極易進(jìn)行操作，對(duì)試驗(yàn)也沒有藥品暴露風(fēng)險(xiǎn)，個(gè)人覺得比較適合于本科及碩士課程的研究。

EYELHCM-1000葉綠素儀法作為一種測(cè)定植物相對(duì)葉綠素含量極其簡(jiǎn)便的方法，由于結(jié)果不準(zhǔn)確，故參考價(jià)值不大。但是此方法卻很簡(jiǎn)單易測(cè)，并且儀器也很方便攜帶，同時(shí)也有研究表明，經(jīng)過校正的葉綠素儀能對(duì)田間生長(zhǎng)的植物的葉綠素含量進(jìn)行準(zhǔn)確快速的測(cè)定[8]。若待測(cè)植物的葉片面積可以達(dá)到儀器的要求，那么用來測(cè)量抽穗期的小麥葉片葉綠素含量還是比較適宜的。

原子吸收光譜法由于是一種間接的方法，很多人并不采用，但是由于其試驗(yàn)過程很嚴(yán)謹(jǐn)，對(duì)藥品的使用量有一定限度，只需把鎂元素從葉綠素中萃取出來，它就不會(huì)有損失，如果采用直接方法測(cè)葉綠素含量，不可避免的會(huì)使待測(cè)液中葉綠素降解，導(dǎo)致含量降低。并且本試驗(yàn)結(jié)果也顯示它所測(cè)得的含量最高、最準(zhǔn)確，所以比較適用于科學(xué)研究。

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