新型冠狀病毒核酸熒光型RT-RAA檢測方法的建立及其評價
2021-07-02 07:24:52劉伯玉任翠平蘆寶靜
安徽醫科大學學報 2021年6期
高 越，劉伯玉，任翠平，高 勇，朱 禹，楊 莉，溫 萌，錢 振，蘆寶靜，柳 燕
新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 19，COVID-19)是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起的急性傳染病。此次疫情在全球范圍內快速蔓延，WHO已將其認定為國際公共衛生緊急事件。冠狀病毒(coronavirus，CoVs)是一種有包膜的單鏈正鏈RNA病毒，隸屬于冠狀病毒科。病毒基因組中16個非結構蛋白由5′端的開放閱讀框架(ORF)1a/b編碼，而結構蛋白包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)則由3′端的其他ORF編碼。由于潛伏期長，感染者的早期癥狀無特異性，且存在無癥狀感染者，極易造成漏診或誤診，因此，建立更便捷、快速的分子檢測方法，為臨床提供精準診斷具有重要意義。
該研究建立的反轉錄重組酶介導核酸擴增(reverse transcription recombinase aided amplification，RT-RAA)技術是一種等溫快速擴增檢測方法，通過是選擇SARS-CoV-2的S
基因和orf1ab
基因，設計特異性等溫擴增引物和探針，建立了SARS-CoV-2快速診斷的分子檢測方法，并進行初步評價。1 材料與方法
1.1 材料
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樣本 收集2020年1月20日—2月28日的臨床確診感染SARS-CoV-2患者咽拭子標本30例來自于項目合作單位安徽省阜陽市第二人民醫院，COVID-19的診斷依據是中國國家衛生委員會發布的新的《冠狀病毒肺炎防治方案(第五版)》；另外臨床呼吸道感染咽拭子標本30份為2019年底前本實驗室收集，經核酸檢測分別包括H9N2(3例)、H7N9(2例)、H3N2(5例)、H1N1(6例)、B型流感(6例)、RSV(3例)、RV(5例)。納入研究的所有患者都知情同意，經安徽醫科大學人類生物倫理學委員會批準，批準號為2020H015。1
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主要儀器及試劑 體外轉錄試劑盒RiboMAXLarge Scale RNA Production System-T7(美國Promega公司，貨號：P1300)；二級生物安全柜、GENCHECK-1熒光檢測儀(杭州眾測生物科技公司)；實時熒光定量 PCR 儀(美國Bio-Rad公司，型號：CF-X96TM)；RNA核酸提取RNeasy Mini Kit (德國QIAGEN公司，貨號：74106)；磁珠核酸提取試劑(江蘇泰州碩世生物科技有限公司，貨號：SDK60104)；全自動核酸提取儀(蘇州華益美生物科技有限公司，型號：SLAD14800)；新型冠狀病毒 2019-nCoV 核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)(上海伯杰醫療科技有限公司，貨號：ZC-HX-201-2)；重組質粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；質粒提取試劑盒(美國AXYGEN公司，貨號：AP-MN-250)；RT-RAA核酸擴增試劑盒熒光型(杭州眾測生物科技有限公司，貨號：S004ZC)。1.2 方法
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引物探針設計及篩選 從GenBank數據庫下載SARS-CoV-2病毒全序列，通過Bioedit (v7.0.9.0)軟件進行多重序列比對，根據對比結果找出具有高同源性的保守區域，最終選擇SARS-CoV-2保守性較高的S
基因和orf1ab
基因作為靶基因，并與其他冠狀病毒序列進行比較，將GenBank登錄號為MN908947.3的SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1基因組序列作為引物、探針設計的候選序列，用Oligo (v7.56)軟件進行探針和引物設計。依據恒溫快速擴增技術設計原則對兩個靶基因分別設計上、下游引物各 3條，以及4條探針進行第一輪篩選，為進一步提高其擴增效率，依據引物篩選策略，在第一輪篩選結果的基礎上將待選引物堿基位置及數量做進一步調整。經補充設計orf1ab
基因4條上游引物和4條下游引物,S
基因2條上游引物和2條下游引物進行第二輪篩選，確定可良好工作的引物和探針。見表1。
表1 SARS-CoV-2引物和探針序列
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探針修飾 探針的修飾方法包括：熒光標記基團為FAM，熒光淬滅基團為 BHQ1。S
基因的探針熒光報告基團修飾在探針序列距5′端堿基數31 bp 的位置上；熒光淬滅基團修飾在探針序列距 3′端堿基數 13 bp 的位置上，熒光報告基團與淬滅基團之間間隔 4 個堿基(TTGA)，其中第2個堿基T用四氫呋喃殘基替換,序列尾部加上C3 spacer修飾。orf1ab
基因的探針中熒光報告基團修飾在探針序列距5′端堿基數31 bp 的位置上，熒光淬滅基團修飾在探針序列距 3′端堿基數 14 bp 的位置上，熒光報告基團與淬滅基團之間間隔3個堿基(GGG)，其中第2個堿基G用四氫呋喃殘基替換,序列尾部加上C3修飾，經過修飾的探針如表2所示。
表2 SARS-CoV-2修飾探針序列
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體外轉錄RNA 針對SARS-CoV-2的S
基因和orf1ab
基因分別設計一對帶有T7啟動子的引物，其序列如表3所示，利用表中引物分別對含有相應S
基因和orf1ab
基因序列的質粒進行PCR擴增，采用RiboMAXLarge Scale RNA Production System-T7試劑盒對SARS-CoV-2進行體外轉錄，分別獲得S
基因和orf1ab
基因的 RNA 模板，采用 Nanodrop 2000分光光度計測量純化后RNA產物的質量濃度，計算出S
基因orf1ab
基因的濃度為3.68×10、4.02×10拷貝數/μl。
表3 質粒PCR擴增引物序列
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Real-time PCR檢測SARS-CoV-2 采用磁珠核酸提取試劑盒提取樣本核酸，將提取的核酸模板液20 μl轉移至已分裝擴增混合液的PCR反應管中，蓋上管蓋，混勻，離心后放入多通道核酸檢測儀。根據試劑說明書,用FAM通道檢測orf1ab
基因，HEX/VIC通道檢測N基因，ROX通道檢測內參基因；陽性和陰性的判斷標準參照試劑盒說明書，在內參基因Ct值≤38的情況下：①兩種基因Ct值均≤38，樣本為陽性； ②兩種基因均無Ct值或Ct值>38，樣本為陰性； ③單個基因為陽性時，為可疑標本。1
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RT-
RAA反應體系的建立及優化 商品化熒光RAA試劑盒包含A、B緩沖液。每反應管總體積為50 μl， RT-RAA等溫擴增試劑的反應體系如表4所示。
表4 RT-RAA反應體系
如上配置好反應體系后，蓋上管蓋，上下顛倒充分混勻5～6次，低速離心10 s，將檢測單元管放入恒溫擴增熒光檢測儀，選用經過優化的RT-RAA程序:40.5 ℃，每 30 s讀取一次熒光值，循環40次，共20 min。啟動儀器。陽性和陰性的判斷標準：陽性結果一般以顯示典型的擴增曲線判定，陰性結果和對照一般顯示為水平直線(即未采集到熒光信號)或輕微斜線。
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靈敏性檢測 將SARS-CoV-2體外轉錄RNA稀釋為10、10、10、10、1 拷貝數/μl共5個濃度梯度，并使用無核酸酶的水作為陰性對照，用已優化好的反應體系進行等溫擴增，測試方法的靈敏度。1
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特異性檢測 將COVID-19疫情之前，經核酸檢測驗證為其他呼吸道病毒感染的流感的30例咽拭子標本提取RNA，分別將S
基因和orf1ab
基因的體外轉錄RNA 模板作為陽性對照，使用無核酸酶的水作為陰性空白對照，對 RT-RAA等溫快速擴增技術進行特異性評價，通過收集熒光信號判斷其他病毒是否有擴增。1
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重復性檢測 用已優化好的反應體系分別將S
基因引物和orf1ab
基因引物的最低檢出限2 拷貝數/反應管的SARS-CoV-2體外轉錄RNA模板進行3次重復實驗，并使用無核酸酶的水作為陰性對照，測試該方法的重復性。1
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臨床標本驗證 提取本次研究檢測的60例臨床樣本中RNA，用建立的RT-RAA等溫快速擴增方法對臨床標本進行檢測，并與Real-time PCR的檢測結果進行比較，計算Kappa值(采用SPSS 13.0統計軟件)，分析兩種檢測方法檢測結果的一致性，并計算出各引物的陽性符合率和陰性符合率，以此判斷本研究建立的SARS-CoV-2 RT-RAA方法的臨床檢測效果。1
.3 統計學處理
應用SPSS 13.0軟件進行統計學處理，兩組間的一致性比較采用Kappa檢驗，α=0.05檢驗水準下，Kappa值越接近1，說明兩組間的一致性越好。2 結果
2.1 SARS-CoV-2 RT-RAA方法的建立及優化
本研究根據orf1ab
和S
基因設計多對引物和探針，為了確定最合適的引物、探針和反應溫度，分別對S
基因和orf1ab
基因的引物和探針進行了一系列的排列組合，并用濃度為10拷貝數/μl的體外轉錄的SARS-CoV-2 RNA模板在39～42 ℃之間做溫度梯度探索，結果顯示在40.5 ℃時，表1所列的引物探針能在最短的時間熒光強度達到最高，因此確定本研究建立的RAA方法的最佳反應溫度為40.5 ℃。RAA熒光法最佳反應條件為40.9 μl A緩沖液、上游引物、下游引物(10 μmol/L)各2 μl，0.6 μl探針(10 μmol/L)，2 μl模板至47.5 μl，最后向檢測單元管蓋上加入2.5 μl的B緩沖液,并混勻。2.2 RT-RAA方法的靈敏性
對于所稀釋的各濃度的體外轉錄RNA，其S
基因和orf1ab
基因均可檢出，且2種基因的最低檢出限均可達到2 拷貝數/反應管。S
基因檢出最低檢測線的用時為11 min,orf1ab
基因檢出最低檢測線的用時為9 min。見圖1。以上表明，本研究建立的RT-RAA 檢測方法靈敏性好，且檢測速度快。
圖1 RT-RAA等溫擴增技術靈敏性檢測A：S基因；B：orf1ab基因
2.3 RT-RAA方法的特異性
僅有SARS-CoV-2陽性對照有擴增曲線，為陽性，其他病毒及陰性對照均無擴增，顯示本研究建立的RT-RAA等溫擴增技術具有良好的特異性。見圖2。
圖2 RT-RAA等溫擴增技術特異性評價A:S基因；B:orf1ab基因
2.4 RT-RAA方法的重復性
S
基因引物和orf1ab
基因引物的SARS-CoV-2體外轉錄RNA模板進行3次重復實驗的結果如圖3所示，結果顯示2種引物擴增反應起峰時間一致，曲線形態接近，陰性對照無擴增，具有良好的重復性。
圖3 RT-RAA等溫擴增技術重復性評價A：S基因；B:orf1ab基因
2.5 RT-RAA方法檢測臨床標本的符合率
本次研究檢測的共60例臨床樣本，結果如表5與表6所示。與Real-time PCR結果相比，S
基因的陽性總符合率為96.66%,陰性總符合率為100%;orf1ab
基因的陽性總符合率為100%，陰性總符合率為100%。經SPSS13.0軟件進行Kappa檢驗，S
基因的Kappa值為 0.967，orf1ab
基因的Kappa值為1，提示本研究建立的RT-RAA等溫快速擴增技術與Real-time PCR檢測結果的一致性極好，兩種引物均有較好的臨床檢測效果。
表5 RT-RAA等溫擴增技術檢測臨床標本S基因結果驗證情況
表6 RT-RAA等溫擴增技術檢測臨床標本orf1ab基因結果驗證
3 討論
SARS-CoV-2疫情的爆發對國際衛生構成重大威脅。當前全球六大洲、200多個國家和地區受到新型冠狀病毒肺炎疫情不同程度的影響。目前，尚未有針對該病毒的特異治療方法且相關疫苗正在研發中。因此，建立一種針對SARS-CoV-2的現場便攜式快速檢測方法，彌補一些昂貴的檢測設備帶來的檢測能力不足的缺陷，對SARS-CoV-2的防控具有重大價值。
該病毒最初是通過RT-PCR和咽拭子測序確認。后來，檢測SARS-CoV-2的Real-time PCR方法迅速建立，并在國內外得到廣泛應用。但該方法需要昂貴的實驗儀器，且大多數的Real-time PCR試劑盒的靈敏度較低(10拷貝數/μl)，有報道稱患者出院后一段時間又出現核酸復檢陽性，這可能由多種原因造成，如患者出院時核酸濃度未達到Real-time PCR檢出限導致陰性誤判、標本采集及運輸過程的不規范操作、擴增儀孔內溫度差異、核酸提取過程中的損耗等影響檢測結果。因此，需要現場開展更高的核酸靈敏度檢測以有效解決上述問題帶來的不利影響。
已有報道建立了RPA擴增方法用于檢測新型冠狀病毒的特異性S
基因以及N
基因。但目前國內使用的RPA試劑均需進口，經濟成本高、不穩定等因素多，而RAA技術是一種具有我國自主知識產權的等溫核酸擴增技術，不受國外專利限制，且試劑成本低廉，不需昂貴的儀器。并且，相對于RPA使用的噬菌體T4uvsX重組酶，RAA使用的細菌或真菌中獲得的重組酶不僅來源更為廣泛，而且在37 ℃恒溫下便可與引物緊密結合形成酶-引物聚合體，反應的溫度適應性更強。本研究建立的RT-RAA 檢測方法通過熒光探針實現檢測，以S
基因和orf1ab
基因作為靶標，通過對反應體系的優化，對于SARS-CoV-2 RNA的模板，其兩種引物均可穩定檢出,靈敏性達到2拷貝數/反應管，且重復性較好。同時與其他相關病毒無交叉反應，特異性好，與Real-time PCR方法相比，臨床樣本S
、orf1ab
基因的陽性符合率為96%、100%，陰性符合率為100%；通過Kappa檢驗表明與Real-time PCR檢測結果有較好的一致性。S
基因的陽性符合率沒有達到100%，其靈敏度未達到理論值的1拷貝數/μl,可能是由于該研究所用的體外轉錄RNA中的RNA純度較高，因此未能完全模擬出對于Real-time PCR檢出33