ACE2、TMPRSS2表達與小鼠COVID-19易感年齡及潛在靶器官關系的探討

喻博識，陳文娟，陳小慧，王星云，余章斌，韓樹萍

新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)對全球人類健康構成重大威脅。COVID-19潛伏期平均5～7 d，因年齡及免疫狀況差異，患者從癥狀出現到死亡時間為6～41 d，70歲以上患者重癥率明顯高于70歲以下；輕、中癥患者癥狀輕微，以發熱、乏力和干咳為主，部分患者可出現呼吸困難、低氧血癥和急性呼吸窘迫綜合癥，發展為重癥肺炎而危及生命；住院患者中因感染導致的心肌損傷(心肌炎、心肌缺血等)發生率很高，此外惡心、嘔吐和腹瀉等胃腸道癥狀也較常見；COVID-19由新型冠狀肺炎病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起，SARS-CoV-2利用冠狀病毒刺突糖蛋白(S蛋白)與宿主血管緊張素轉換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)受體結合進入細胞，而S蛋白則需要跨膜絲氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serine 2, TMPRSS2)的啟動激活，TMPRSS2-SARS-CoV-2 S蛋白-ACE2感染軸被認為是SARS-CoV-2感染宿主細胞的潛在入侵通路；SARS-CoV-2與SARS-CoV有88%的同源性，但SARS-CoV-2 S蛋白與細胞表面ACE2受體的結合能力是SARS-CoV S蛋白的10～20倍，表明SARS-CoV-2具有更強傳染能力，這也是目前COVID-19全球大流行的原因之一。該研究擬檢測ACE2與TMPRSS2在小鼠不同年齡、不同組織中基因和蛋白的表達，揭示COVID-19的易感年齡與潛在靶器官。

1 材料與方法

1.1 材料

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實驗動物及分組 根據文獻所述小鼠年齡分段標準，于南京醫科大學醫藥實驗動物中心購買不同年齡雄性C57BL/6小鼠共12只，均分為四組：新生組，1～3日齡；幼齡組，1月齡；成年組，3月齡；老齡組，18月齡。

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主要試劑與儀器 TRIzol 購自美國Invitrogen 公司；動物組織總RNA 提取試劑盒購自北京天根公司；逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒購自日本TAKARA公司；ACE2、TMPRSS2和GAPDH引物序列由查詢基因序列網站(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)所得，并委托南京銳真生物科技公司合成；Real-time PCR儀(美國UVP公司產品)；BCA蛋白定量試劑盒(北京碧云天生物有限公司)；ACE2兔源抗體( 稀釋濃度為1 ∶1 000)、TMPRSS2兔源抗體(稀釋濃度為1 ∶1 000)、GAPDH兔源抗體稀釋濃度為1 ∶5 000)(美國Affinity公司)。

1.2 方法

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小鼠和人的ACE

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、TMPRSS

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蛋白氨基酸序列保守性分析 通過氨基酸序列查詢網站(https://www.uniprot.org/)對小鼠和人的ACE2、TMPRSS2蛋白進行Protein BLAST蛋白氨基酸序列保守性分析。

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組織樣品制備 將12只不同年齡小鼠麻醉(10%水合氯醛腹腔注射，0.05 ml/10 g)后，分別取肺、小腸和心臟組織，每份不同組織來源樣品又分為3份：1份組織為50 mg用于總RNA提取及后續的RT-qPCR實驗；1份組織為200 mg用于組織蛋白提取；剩余組織置于EP管-80 ℃凍存備份。

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RT-qPCR檢測小鼠ACE2、TMPRSS2 mRNA表達量 小鼠ACE2、TMPRSS2 mRNA表達量采用RT-qPCR檢測。① 總RNA提取：用TRIzol試劑從組織中分離總RNA；② 逆轉錄：利用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA;③ 擴增：用PCR的方法擴增cDNA;④檢測:實時檢測和定量擴增的產物。擴增結束后所得Ct 值采用相對定量法以GAPDH 為內參基因計算目的基因表達量，讀取目的基因及內參基因的循環閾值(Ct值)，并計算目的基因與內參基因Ct值差值(ΔCt)，以2值代表目的基因mRNA表達水平，所用引物序列見表1。

表1 小鼠ACE2、TMPRSS2 和GAPDH引物序列

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Western blot檢測ACE2和TMPRSS2蛋白表達量 應用RIPA 裂解液及蛋白酶抑制劑(100 ∶1)提取組織總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度并調節蛋白濃度一致，加入蛋白上樣緩沖液水浴煮沸，分裝后-80 ℃冰箱儲存備用。蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離后常規濕轉法轉移蛋白至PVDF膜上，在5%脫脂奶粉溶液中封閉后與一抗孵育過夜。次日復溫后TBST洗膜、二抗孵育、TBST再次洗滌后加入化學發光液，凝膠電泳成像系統進行圖像采集。

2 結果

2.1 小鼠與人ACE2、TMPRSS2氨基酸序列保守性比較

保守性分析結果顯示，小鼠與人ACE2序列一致性達82.1%，TMPRSS2序列一致性達78.4%，結果提示小鼠和人ACE2與TMPRSS2高度同源。見圖1。

圖1 人和小鼠來源ACE2、TMPRSS2氨基酸序列同源性分析

2.2 不同年齡小鼠同組織間ACE2、TMPRSS2 mRNA表達水平

ACE2、TMPRSS2 mRNA在肺組織中的表達結果顯示：老齡組>成年組>幼齡組>新生組(

F

=81.455、42.144，

P

<0.001、

P

<0.05)，差異具有統計學意義；ACE2、TMPRSS2 mRNA在腸道組織中的表達結果顯示：老齡組>成年組>幼齡組>新生組(

F

=113.187、169.555，

P

<0.001)，差異有統計學意義；ACE2、TMPRSS2 mRNA在心臟組織中的表達結果提示：成年組>幼齡組>新生組>老齡組(

F

=11.218、159.535，

P

<0.001)，差異有統計學意義。見圖2。

圖2 不同年齡組小鼠相同組織間ACE2、TMPRSS2 mRNA表達水平差異

2.3 同齡小鼠肺、小腸和心臟組織ACE2和TMPRSS2 mRNA表達水平

新生組小鼠肺組織ACE2、TMPRSS2 mRNA表達高于小腸和心臟組織(

F

=172.185、90.314，

P

<0.001)；幼齡組小鼠肺組織ACE2、TMPRSS2 mRNA表達高于小腸和心臟組織(

F

=211.336、224.434，

P

<0.001)；成年組小鼠肺組織ACE2、TMPRSS2 mRNA表達高于小腸和心臟組織(

F

=377.493、73.239，

P

<0.001)；老齡組小鼠肺組織ACE2和TMPRSS2 mRNA表達高于小腸和心臟組織(

F

=136.343、778.623，

P

<0.05)。見圖3。

圖3 同齡小鼠肺、小腸和心臟組織ACE2和TMPRSS2 mRNA表達水平

2.4 不同年齡小鼠不同組織間ACE2、TMPRSS2蛋白表達水平

不同年齡組同組織水平，小鼠肺組織和小腸組織ACE2、TMPRSS2蛋白表達隨年齡增長而逐漸增高，心臟組織幼年組和成年組表達水平逐漸升高，老齡組則表達下降；同年齡維度下，肺組織表達量較高，小腸次之，心臟最低，趨勢與基因水平一致。見圖4。

圖4 不同年齡小鼠同組織間ACE2和TMPRSS2蛋白表達水平以及同齡小鼠肺、小腸和心臟組織ACE2和TMPRSS2 蛋白表達水平

3 討論

ACE2、TMPRSS2在特定組織的同時高表達，構成了TMPRSS2-SARS-CoV-2 S蛋白-ACE2感染軸，這是SARS-CoV-2的潛在感染途徑。ACE2是一種附著在肺、心臟、腎臟和腸道等細胞外表面(細胞膜)的酶，屬于血管緊張素轉換酶家族；ACE2在器官的特異性表達提示其可能在調節心血管和腎臟功能以及生育方面發揮作用。此外，ACE2作為一種跨膜蛋白，是某些冠狀病毒包括HCoV-NL63、SARS-CoV(引起SARS的病毒)和SARS-CoV-2(導致COVID-19的病毒)進入細胞的主要結合受體。具體而言，SARS-CoV-2的S蛋白與細胞表面ACE2酶促結構域的結合會導致病毒被內吞和轉運進入細胞，這種進入過程還需要宿主TMPRSS2引發S蛋白的啟動，TMPRSS2屬于絲氨酸蛋白酶家族，已有研究顯示，S2位點的第2個精氨酸可能是TMPRSS2激活中東呼吸綜合征冠狀病毒S蛋白所必需的，TMPRSS2激活SARS-CoV-2 S蛋白的具體機制，則有待進一步研究。有研究顯示，雄激素受體拮抗藥物可抑制ACE2和TMPRSS2的表達，并抑制男性COVID-19患者過度的炎癥反應，此類抑制ACE2或TMPRSS2表達的藥物或可治療COVID-19。

臨床研究表明，患者年齡與臨床表現乃至預后存在確切相關性，且肺、小腸和心臟均可能是SARS-CoV-2靶器官。相對成人而言，大多數SARS-CoV-2感染患兒有更輕微的臨床表現，無癥狀感染患兒也不少見。已有研究表明，COVID-19主要影響呼吸功能，絕大多數患者因呼吸衰竭死亡；此外，心臟損傷是COVID-19的一個顯著特征，通常意味著更差的預后。患者還出現惡心、嘔吐和腹瀉等胃腸道癥狀，腹瀉是兒童和成人最常見的胃腸道癥狀，嘔吐在兒童中更為突出。

小鼠、人ACE2和TMPRSS2氨基酸序列保守性分析結果顯示，小鼠源ACE2和TMPRSS2與人源ACE2和TMPRSS2具有高度相似性。有研究顯示，ACE2 的18個氨基酸殘基通過氫鍵、鹽橋或多個范德華力與SARS-CoV-2S蛋白受體結合區域 的14 個氨基酸殘基相互作用，故檢測小鼠水平ACE2與TMPRSS2表達對揭示人類SARS-CoV-2易感性的年齡差異與潛在靶標具有一定參考價值。

本研究檢測不同年齡小鼠同組織間ACE2和TMPRSS2 mRNA及蛋白表達水平。實驗結果表明：ACE2和TMPRSS2 mRNA及蛋白表達水平在肺和小腸組織中，隨著年齡增長逐漸升高，這與已有臨床證據，即相對成人而言，大多數SARS-CoV-2感染患兒有更輕微的臨床表現，較小年齡與較低病死率存在相關性這一現象基本符合。同樣，檢測同齡大鼠肺、小腸和心臟組織ACE2和TMPRSS2 mRNA及蛋白表達水平，實驗結果表明：肺組織表達量較高，小腸次之，心臟最低；驗證了肺是SARS-CoV-2最主要的靶器官，COVID-19主要損害患者呼吸功能。

小鼠ACE2、TMPRSS2 mRNA及蛋白表達水平的年齡差異一定程度解釋了目前不同年齡人群對COVID-19的易感性差異及不同年齡患者的臨床表現差異,但尚有其它干擾因素需要考慮，如一項前瞻性研究顯示，男性高齡患者，伴有基礎疾病等與COVID-19重癥和死亡風險增加有關。小鼠ACE2、TMPRSS2 mRNA及蛋白表達水平的組織差異解釋了肺作為SARS-CoV-2入侵首要靶器官的原因。但ACE2、TMPRSS2 mRNA及蛋白表達水平高低與組織病變程度并不是絕對正相關，如心臟相對肺部和小腸低表達，而住院患者中SARS-CoV-2感染導致的心肌損傷(心肌炎/心肌缺血等)發生率很高。一項回顧性隊列研究表明，老年、炎癥反應和潛在的心血管并發癥和SARS-CoV-2感染導致的心肌損傷有關，具體機制可能涉及感染后期的直接病毒損傷、炎性細胞因子/趨化因子介導的免疫損傷和細胞毒性免疫細胞反應，這種機體過度免疫引起的炎癥風暴不僅損傷心肌，更可能導致重癥患者出現多器官功能衰竭，危及生命。最新研究顯示，這種多系統炎癥綜合征若發生在兒童COVID-19患者，會嚴重威脅兒童生命。

綜上所述，隨著C57BL/6小鼠年齡的增長，肺、小腸組織的ACE2和 TMPRSS2基因及蛋白表達隨之增加，提示高齡可能是SARS-CoV-2感染的獨立危險因素之一；肺組織ACE2、TMPRSS2基因和蛋白相對于小腸和心臟等組織的高表達，驗證了肺是SARS-CoV-2入侵機體的首要靶器官。以上研究結果，為COVID-19預防和治療相關研究提供了新思路，ACE2和 TMPRSS2基因及蛋白在不同組織的表達差異，有助提高臨床醫生診斷鑒別COVID-19相關并發癥的敏感度，也提醒臨床醫生注意出院患者的隨訪，觀察遠期預后。同時住院患者中SARS-CoV-2感染導致心肌損傷的較高發生率以及兒童多系統炎癥綜合征等新情況的出現，凸顯了COVID-19及其病原體SARS-CoV-2的復雜性，亟待進一步深入研究。