人耐紫杉醇去勢性前列腺癌細胞系的構建*

吳昌學, 李毅, 張婷, 彭煜暉, 張健, 禹文峰, 柏華, 張啟芳**

(1.貴州醫科大學 地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室 & 貴州省醫學分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學第三附屬醫院 醫學實驗中心， 貴州 都勻 558000)

前列腺癌是男性最常見的腫瘤之一，也是男性癌癥相關死亡的主要原因，藥物治療仍然是控制前列腺癌的首要方法[1]。但有20%～30%的前列腺癌患者在確診后3年內會發展為去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer CRPC)，大部分CRPC患者在治療一段時間后會出現耐藥的情況，給臨床治療帶來困擾[3]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是一種從紅豆杉樹皮分離提純、具有抗癌活性的類化合物[4-5]，可誘導與促進微管蛋白聚合和裝配、防止解聚，從而使微管穩定，并抑制癌細胞的有絲分裂和觸發細胞凋亡，進而有效阻止癌細胞的增殖[6]。除肉瘤、淋巴瘤和白血病外，PTX還用于胃食管癌、子宮內膜癌、乳腺癌、晚期宮頸癌及前列腺癌的治療[7-11]，亦是治療CRPC患者的標準抗癌藥物之一，但在治療過程中患者會發生獲得性耐藥[12]。因此，闡明人源去勢性前列腺癌細胞株細胞對PTX耐藥的分子機制，對于CRPC患者新的治療策略研發至關重要。因此本研究以人源去勢性前列腺癌細胞株DU145細胞作為研究對象，通過PTX濃度遞增的方法處理DU145細胞、建立人耐PTX去勢性前列腺癌細胞系，然后使用低于最高處理濃度的PTX培養基保持細胞株的活性，為后續研究提供人耐PTX去勢性前列腺癌細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞系 人源去勢性前列腺癌細胞株DU145細胞購于美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)。

1.1.2主要試劑和儀器 PTX和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；美國 Sigma)，Trizol(美國Invitrogen)，cDNA 逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa )，HiffTMq PCR SYBR Green Master Mix熒光定量試劑盒(上海翊圣)，兔抗多耐藥基因1(multiple drug resistant gene 1, MDR1)抗體、兔抗β-Tubulin抗體及辣根過氧化物酶標記的兔二抗(美國CST)，二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒和蛋白Marker(美國Thermo)，超敏化學發光試劑盒(enhanced chemiluminescence，ECL)和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美國 Millipore)，ELX800UV 酶標儀(美國Bio-Tec)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 DU145細胞培養于含10%胎牛血清、1×Antibiotic-Antimycotic的RPMI 1640培養液中，培養條件為含5%CO2的37 ℃培養箱。

1.2.2人耐PTX前列腺癌細胞株DU145R的構建及細胞核觀察 采用濃度遞增的方法(以1、4、6、8、10、及12 nmol/L的PTX)處理DU145細胞(處理過程中確保DU145細胞不會死亡)，12 nmol/L濃度處理后存活的DU145細胞作為PTX耐藥細胞株(命名為DU145R，此后以10 nmol/L的PTX維持培養)，收集DU145R細胞，均分為4份，一份用于檢測細胞活性，一份在100×顯微鏡下觀察細胞核形態，另外2份用于人MDR1和c-Myc mRNA和蛋白表達水平的檢測。以正常培養的DU145細胞作為對照。

1.2.3細胞活性檢測 采用細胞增殖檢測(cell counting kit-8,CCK8)法檢測，將處于對數生長期的DU145、 DU145R細胞懸液調整細胞濃度為1×104個/孔，接種于96孔板中。使用0.25 μmol/L PTX處理 72 h，按照說明，使用CCK8試劑盒檢測450 nm處的吸光度(optical density，OD)值，評估細胞活力。

1.2.4MDR1和c-MycmRNA表達水平 采用實時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR，qPCR)檢測，用Trizol試劑提取細胞總RNA，按cDNA 逆轉錄和熒光定量試劑盒說明書分別進行反轉錄和qPCR反應。qPCR 引物由武漢思特進科技發展有限公司合成，MDR1上游引物為5′-GCAGCTGGAAGACAAATACACAAA-3′，下游引物為5′-CCCCAACATCGTGCACATC-3′。c-Myc基因上游引物為5′- TACCCTCTCAACGACAGCAG-3′， 下游引物為5′- TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3′。內參照次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因上游引物為5′-CATTATGCTGAGGATTTGGAAAGG-3′， 下游引物為5′-CTTGAGCACACAGAGGGCTACA-3′。反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s、 60 ℃退火30 s，40個循環。采集目的基因CT值，以內參照HPRT作為標準，計算MDR1和c-Myc基因相對表達量(RQ)，RQ=2-ΔΔCt。

1.2.5MDR1 和c-Myc蛋白表達水平 采用Wes-tern blot法檢測，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉移到PVDF膜上，常規一抗和二抗孵育后，ECL超敏免疫印跡檢測試劑 (Amersham公司) 檢測蛋白表達。

1.2.6c-MyCmRNA表達分析 用在線軟件TIMER2.0 (http://cistrome.dfci.harvard.edu/TIMER/)的 Gene_差異表達模塊分析癌癥基因圖譜( the cancer genome atlas ,TCGA)中所有腫瘤(20多種腫瘤數據, 包括患者的臨床預后資料)，分析c-Myc基因在腫瘤與鄰近正常組織間的表達差異，其中包括前列腺癌。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 DU145R細胞核變化

按照1、4、6、8、10、及12 nmol/L的PTX濃度處理DU145細胞后獲得DU145R細胞，顯微鏡下觀察發現，與正常培養的DU145細胞比較，耐藥DU145R細胞出現多核化。見圖1。

DU145 DU145R注：白色箭頭所示為多核化。

2.2 DU145細胞與耐藥DU145R細胞的活性

CCK8法檢測結果顯示，DU145細胞和DU145R細胞分別加入 0.25 μmol/L PTX處理 72 h后，DU145細胞活力(17.3%)低于DU145R細胞活力(79.2%)，差異有統計學意義(P<0.01)。 見圖2。

注：(1)與DU145細胞比較， P<0.01。

2.3 耐藥細胞DU145R中MDR1表達

MDR1是許多腫瘤細胞耐藥的標志。本研究結果顯示， DU145R細胞的MDR1 mRNA 表達水平較DU145細胞上調了82.3倍，與DU145細胞比較，差異有統計學意義(P<0.01)； MDR1蛋白在DU145細胞的表達很低，在DU145R細胞的表達水平也被上調。見圖3。

注：A為 MDR1 mRNA 表達，B為MDR1 蛋白表達；(1)與DU145細胞比較，P<0.001。

2.4 耐藥細胞DU145R中c-Myc表達

研究結果顯示， DU145R細胞的c-Myc mRNA 和蛋白表達水平較DU145細胞升高，差異有統計學意義(P<0.01)；在線軟件TIMER2.0分析發現， 與鄰近正常組織比較，c-MycmRNA在多種腫瘤組織均有表達，但其表達水平有升高也有降低(P<0.05)；在前列腺癌組織，c-MycmRNA表達水平升高(P<0.05)。見圖4。

注： A為c-Myc mRNA 定量表達，B為c-Myc 蛋白表達及定量結果，C為 c-Myc在多種正常和腫瘤組織的mRNA表達，紅色表示腫瘤組織， 蘭色表示正常組織；紅色方框線內為前列腺癌組織與前列腺組織c-Myc mRNA相對表達量； (1)與DU145細胞比較，P<0.001；與正常組織比較， (2)P<0.001，(3)P<0.05，(4)P<0.01。

3 討論

運用PTX進行藥物治療能提高CRPC病人的生存率，是目前治療CRPC患者的主要藥物[12]。雖然治療初期效果良好，但隨著治療時間的延長，可能會出現PTX耐藥，影響了PTX的療效，減少了CRPC患者治療選擇[13]。用化療藥誘導的耐藥細胞，比較接近腫瘤患者腫瘤耐藥細胞的表型[14]， 這也是目前細胞水平研究腫瘤細胞耐藥分子機制的主要手段[14]。使用PTX誘導產生的耐藥細胞系是在體外單純環境下誘導的，沒有腫瘤微環境的影響，耐藥細胞系不可能完全與腫瘤病人腫瘤耐藥細胞的表型一致；其次，從腫瘤病人獲取腫瘤耐藥細胞的前提是病人只使用了一種藥物，產生了耐藥，這種耐藥細胞非常難得[14]。除此之外，相同腫瘤的病人對相同藥物耐藥的細胞表型也不完全一致。

研究表明耐藥細胞多核化是耐藥細胞的變化之一，多核多倍體促進人源去勢性前列腺癌細胞株細胞PC3多西他賽的耐藥性[15]；卡巴他賽處理導致人源去勢性前列腺癌細胞多核化增強了卡巴他賽的抗性[15]。這些研究支持本研究的結果，建立的DU145R細胞出現多核化。PTX通過作用腫瘤細胞微管起到抑制腫瘤細胞生長，但是長期的PTX刺激，出現多核多倍體，引起細胞增大，暗示PTX改變細胞核的功能，將在后續工作中研究PTX對細胞核的作用。

此外，細胞活力(生長曲線)的測定結果表明在PTX處理后DU145R細胞活性明顯高于DU145細胞活性，說明DU145R細胞比DU145細胞對PTX敏感性降低，具有抵抗性。人源去勢性前列腺癌細胞PTX耐藥的機制比較復雜，其中MDR1 上調是其中之一。MDR1是ATP-結合盒(ATP-binding cassette, ABC)轉運蛋白家族成員之一[16]，是ATP依賴性藥物外排泵, 即MDR1把藥物運到細胞外，阻止了藥物對細胞發揮作用。MDR1表達上調是腫瘤細胞產生多藥耐藥(multi-drug resistance, MDR)的重要機制之一。 MDR1的表達在PTX耐藥的人源去勢性前列腺癌細胞株PC3被上調； 在多西他賽前列腺癌被上調；在卵巢癌細胞MDR1表達促進了PTX和奧拉帕尼耐藥[17-19]。與前人研究結果相似， 與DU145相比，MDR1在本研究建立的DU145R細胞的表達在mRNA和蛋白水平被上調，說明DU145R細胞具有耐藥性。

除此之外，越來越多的證據表明c-Myc是促進腫瘤細胞化療耐藥的主要原因之一，如持續誘導c-Myc表達有助于胰腺導管癌細胞中的nab-PTX耐藥性，抑制 c-Myc可以減輕前列腺癌中的恩雜魯胺(enzalutamide)耐藥性，降低急性白血病對BET抑制劑的耐藥[20-22]。c-Myc 協調髓細胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1，MCL-1)共同促進乳腺癌細胞化療耐藥， 維持c-Myc表達促進人源去勢性前列腺癌細胞對BET bromodomain 抑制劑的獲得性耐藥，沉默c-Myc表達可以增強CRPC細胞對PTX的敏感性[23-25]。這些研究支持本研究的實驗結果，c-Myc在DU145R細胞表達明顯高于DU145細胞。

綜上所述，本次實驗成功建立了耐PTX前列腺癌細胞系，為后續研究提供了PTX CRPC細胞耐藥模型。