circ-SFMBT2通過miR-224-5p/USP3軸對肝癌細胞增殖及遷移能力的影響*

伍玉海， 戴大飛， 葉蕊， 于北北， 張書軍， 陳曉鵬***

(1.皖南醫學院 研究生院， 安徽 蕪湖 241002； 2.皖南醫學院第一附屬醫院弋磯山醫院 肝膽一科， 安徽 蕪湖 241001)

目前越來越多的研究發現非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)在對疾病的調控中發揮重要作用，其中包括環狀RNA( circular RNA，circRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)[1]。circRNA是通過部分基因外顯子環化而成的，由于沒有3′-尾巴和5′-帽子結構，進而避免了RNA酶消化，可穩定存在于細胞內[2]，因此circRNA可被用作腫瘤的診斷探針[3]。研究發現circRNA可通過靶向吸附miRNA來調控基因表達，在癌癥有關的各種生物學過程中充當重要調節劑，包括細胞增殖、侵襲及轉移，進而影響疾病進程[4-6]。本研究circRNA名為hsa_circ_0017639(Geo數據庫中的GSE78092)，hsa_circ_0017639源自基因SFMBT2(scm-like with four mbt domains 2)，因此被命名為circ-SFMBT2。既往研究發現circ-SFMBT2在胃癌組織中表達上調，沉默circ-SFMBT2會顯著抑制胃癌細胞的增殖[7]，circ-SFMBT2通過mirR-182-5p/MTSS1途徑抑制神經膠質瘤細胞的增殖與轉移[8]，circ-SFMBT2在眾多circRNA中屬于一個研究較新的基因，在其他腫瘤等疾病中的作用及機制尚不明確。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上第5大常見的癌癥[9]，circ-SFMBT2在肝癌發生發展的過程中具有研究價值。本研究利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR)發現肝癌細胞高表達circ-SFMBT2，并進一步探究其對肝癌細胞侵襲和遷移的影響以及可能的調控機制，為肝癌治療提供潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞來源 肝癌細胞系HepG2、SMMC7721、Huh-7、Sk-Hep-1及人正常肝細胞細胞系LO2購于中國科學院細胞庫。

1.1.2主要試劑與儀器 胎牛血清、氨基酸葡萄糖培養基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)、Lipo2000轉染試劑及OptiMEM低血清培養基(美國Gibco)，circ-SFMBT2干擾載體和泛素特異性蛋白酶3(Ubiquitin-specific protease 3，USP3)表達載體(上海吉瑪基因生物)，RNA TRIzol提取試劑盒(美國Invitrogen)，pTRUEscript the First Strand cDNA Synthesis Kit和2×SYBR Green qPCR Mix(北京Aidlab)，細胞增殖檢測(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒(上海碧云天)，Transwell小室(美國Corning)，Cy5-標記的circ-SFMBT2探針(上海生工合成)，qRT-PCR儀(瑞士Roche)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與轉染 肝癌細胞系HepG2、SMMC7721、Huh-7、Sk-Hep-1及人正常肝細胞LO2置于含10%胎牛血清DMEM培養基，37 ℃的5%CO2細胞培養箱中培養；將circ-SFMBT2干擾載體、circ-SFMBT2 NC載體、miR-224-5p抑制劑、USP3過表達載體及miR-224-5p模擬物按照Lipo-2000轉染試劑說明書進行轉染，轉染后分別構建circ-SFMBT2干擾組(si-circ-SFMBT2組)、對照組(circ-SFMBT2 NC，NC組)，在si-circ-SFMBT2干擾組的成功模型后繼續轉染miR-224-5p抑制劑構建miR-224-5p抑制組(si-circ-SFMBT2+inhibitor組)、在si-circ-SFMBT2干擾組的成功模型后繼續轉染USP3過表達構建USP3過表達組(si-circ-SFMBT2+USP3組)，HepG2細胞轉染miR-224-5p過表達模擬物成功構建miR-224-5p mimic組(mimic組)，在miR-224-5p mimic組成功模型后繼續轉染USP3過表達載體構建 mimic+USP3組。具體方法是將轉染片段(50 ng)與Lipo2000混合后加OptiMEM培養基培養6 h，換正常DMEM培養基繼續培養，轉染48 h，細胞經qRT-PCR實驗檢測后可進行后續實驗。

1.2.2qRT-PCR 細胞總RNA利用TRIzol試劑進行抽提，利用pTRUEscript the First Strand cDNA Synthesis Kit 進行互補DNA(complementary DNA，cDNA)合成，利用2×SYBR Green qPCR Mix進行qRT-PCR檢測；利用2-ΔΔCt計算方法對結果進行統計分析。實驗重復3次。引物見表1。

表1 目的基因及陰性對照基因引物序列

1.2.3生物信息學分析 circRNA和miRNA之間的靶向作用關系通過Circular RNA Interactome網站進行預測，miRNAs和信使RNA(messger RNAs，mRNAs)之間的靶向作用關系利用TargetScan (http://www.targetscan.org/) 網站進行預測。

1.2.4熒光原位雜交技術和雙熒光素實驗 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)分析Cy5-標記的circ-SFMBT2探針(5′-CTCCTGCGTCGGTGACTAAGCAATCAAAGAGAAGTAC-3′-biotin)由上海生工合成，細胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色。人正常肝細胞細胞系LO2標記為Normal組，肝癌細胞HepG2細胞株標記為HCC組。該實驗按照說明書要求做，觀察并記錄熒光結果。

1.2.5CCK-8 取“1.2.1”項下6組HepG2細胞利用CCK-8試劑盒進行增殖檢測。含有2 000細胞的DMEM培養基100 μL加96孔板，培養0、24、48及72 h，吸棄培養基，分別替換成含有10%CCK-8試劑的DMEM培養基孵育1 h，酶標儀上于 450 nm下測定各組HepG2細胞吸光值(optical density，OD)。

1.2.6克隆斑點形成實驗 取“1.2.1”項下6組HepG2細胞按200個細胞/孔密度接種于6孔板，培養10 d，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色5 min，拍照統計分析。

1.2.7細胞遷移分析 Transwell上室種無血清的DMEM培養基200 μL，其中分別含“1.2.1”項下6組HepG2細胞1×105個，下室加含15%胎牛血清的DMEM培養基500 μL，置于37 ℃的5%CO2細胞培養箱培養24 h，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色5 min，拍照統計分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 circ-SFMBT2的表達

結果顯示，與LO2細胞比較，Huh-7、Sk-Hep-1、SMMC7721及HepG2細胞中circ-SFMBT2表達均上調，其中HepG2細胞中表達上調最為明顯(P<0.05)，因此選擇HepG2細胞作為后續研究對象。見圖1。

注：(1)與LO2比較，P<0.05。

2.2 circ-SFMBT2表達和亞細胞定位檢測

結果表明，HCC組細胞circ-SFMBT2表達較Normal組上調，且circ-SFMBT2主要定位在細胞質中。見圖2。

Normal組 HCC組

2.3 干擾circ-SFMBT2表達后肝癌細胞增殖和遷移能力

qRT-PCR檢測結果表明，與NC組比較，si-circ-SFMBT2組 HepG2細胞 circ-SFMBT2表達下調(P<0.05)；轉染circ-SFMBT2干擾載體后，CCK-8和克隆斑點形成實驗檢測結果顯示，與NC組比較，circ-SFMBT2干擾組HepG2細胞增殖能力降低(P<0.05)；Transwell實驗檢測結果顯示，與NC組比較，circ-SFMBT2干擾組HepG2細胞遷移能力降低(P<0.05)。見圖3。

注：A為轉染后HepG2細胞circ-SFMBT2的表達，B為CCK-8的結果，C～E分別為 NC組和si-circ-SFMBT2組細胞平板克隆實驗形態學和定量結果，F～H分別為Transwell法檢測細胞遷移能力形態學和定量結果；(1)與NC組比較，P<0.05。

2.4 雙熒光素實驗

野生型circ-SFMBT2載體上熒光活力檢測顯示，轉染miR-224-5p過表達mimic片段的293T細胞相較于轉染miR-224-5p NC片段的293T細胞熒光活力下降(P<0.05)；USP3-3′UTR野生型熒光素報告載體上，轉染miR-224-5p過表達mimic片段的293T細胞相較于轉染miR-224-5p NC片段的293T細胞熒光活力下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為circ-SFMBT2熒光載體序列和miR-224-5p轉染片段序列，B為circ-SFMBT2載體上雙熒光實驗定量結果，C為USP3-3′UTR熒光載體序列和miR-224-5p轉染片段序列，D為USP3-3′UTR載體上雙熒光實驗定量結果；(1)與miR-NC組比較，P<0.05。

2.5 細胞轉染實驗和Transwell實驗

qRT-PCR檢測結果顯示，circ-SFMBT2干擾組(si-circ-SFMBT2組)、miR-224-5p干擾組(si-circ-SFMBT2+inhibitor組)及USP3過表達組(si-circ-SFMBT2+USP3組)HepG2細胞circ-SFMBT2的表達均較NC組下調(P<0.05)；與NC組比較，miR-224-5p干擾組HepG2細胞的miR-224-5p表達下調(P<0.05)，circ-SFMBT2干擾組和USP3過表達組HepG2細胞的miR-224-5p表達上調(P<0.05)；與NC組、circ-SFMBT2干擾組及miR-224-5p干擾組比較，USP3過表達組HepG2細胞的USP3表達上調(P<0.05)。克隆斑點形成實驗檢測表明，與NC組比較，circ-SFMBT2干擾組HepG2細胞克隆數量下降、USP3過表達組HepG2細胞克隆數量上升(P<0.05)。Transwell實驗檢測結果表明，與NC組比較，circ-SFMBT2干擾組HepG2細胞遷移細胞數量下降(P<0.05)，USP3過表達組HepG2細胞遷移細胞數量上升(P<0.05)。見圖5。

注：A～C分別為轉染后HepG2細胞circ-SFMBT2、miR-224-5p及USP3的表達，D～H分別為細胞平板克隆實驗形態學和定量的結果，I～M分別為Transwell細胞遷移能力實驗形態學和定量結果；(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與si-circ-SFMBT2組比較，P<0.05。

2.6 克隆斑點實驗和Transwell實驗

qRT-PCR檢測結果顯示，與NC組比較、轉染miR-224-5p過表達模擬物(mimic)后HepG2細胞miR-224-5p表達上調(P<0.05)，同時miR-224-5p過表達組和USP3過表達組相較于mimic組HepG2細胞miR-224-5p表達上調(P<0.05)；與NC組比較，USP3表達在mimic組HepG2細胞中表達下調，在USP3過表達組HepG2細胞中上調(P<0.05)。克隆斑點形成實驗檢測結果表明，與NC組比較，mimic組HepG2細胞克隆細胞數下降、USP3過表達組HepG2細胞克隆細胞數上升(P<0.05)。Transwell實驗檢測檢測結果表明，與NC組比較，mimic組HepG2細胞遷移細胞數下降、USP3過表達組HepG2細胞遷移細胞數上升(P<0.05)。見圖6。

注：A、B分別為轉染后HepG2細胞miR-224-5p和USP3的表達；C、D、E及F為細胞平板克隆實驗形態學和定量的結果，G、H、I及J分別為Transwell細胞遷移能力實驗形態學和定量結果；(1)與NC組比較，P<0.05；(2)與mimic組比較，P<0.05。

3 討論

越來越多的研究表明，circRNA/miRNA/mRNA調控系統在胃癌、乳腺癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌及肝癌等多種癌癥的進展中起著重要的調控作用，均被證實可促進增殖、轉移和化療耐藥[10-13]。既往研究發現，circRNA ABCB10通過吸附miR-670-3p來促進HMG20A表達[14]，circ-FOXP1可通過吸附miR-875-3p來促進SOX9基因表達，進而促進肝癌發生[15]。circ-SFMBT2吸附miR-182-5p，通過調節cAMP反應元件結合蛋白1(cyclic adenosine monophosphate responsive element binding protein 1，CREB1)mRNA表達，從而參與胃癌進展[7]。本研究qRT-PCR檢測結果發現circ-SFMBT2在肝癌細胞中的表達也顯著升高，為進一步探究其在肝癌細胞增殖和遷移中的作用，通過將circ-SFMBT2干擾載體瞬時轉染進HepG2細胞，驗證轉染效率滿意，順利構建si-circ-SFMBT2干擾模型，CCK-8和遷移實驗發現下調circ-SFMBT2后抑制了肝癌細胞增殖和遷移。競爭內源性RNA (competing endogenous RNA, ceRNA)假說認為，circRNAs主要是由外顯子組成，并分布于細胞質中，這與circ-SFMBT2的FISH實驗結果一致，circRNAs能夠通過與AGO2蛋白結合，利用自身含有的miRNA反應元件(microRNA response element， MRE)吸附下游miRNAs來調控基因表達[16]。此外，最近有研究指出circRNAs可以受到m6A甲基化修飾，這也將為circRNAs的機制研究打開新的篇章[17]。上述這些特征表明 circRNAs具有成為疾病診斷的生物標志物和治療靶點的潛力。

生物信息學分析發現circ-SFMBT2下游結合靶點有很多，包括hsa-miR-1290、miR-1296、miR-1305、miR-182、miR-188-3p、miR-198、miR-224-5p、miR-582-3p、miR-587、miR-622、miR-626及miR-885-3p等，但miR-224-5p與circ-SFMBT2之間在結合位點上具有更高的保守性，為了進一步確定circ-SFMBT2、miR-224-5p之間的靶向作用關系，將含有miR-224-5p結合位點的circ-SFMBT2野生型和突變體序列構建到了熒光素報告載體上，和miR-224-5p過表達mimic的片段一起轉染到293T細胞中，結果顯示轉染野生型circ-SFMBT2和miR-224-5p mimic的熒光活力降低，說明circ-SFMBT2和miR-224-5p之間存在靶向作用關系。先前的研究表明，miR-224-5p的表達可以抑制許多癌癥的增殖、遷移[18-20]，并有研究報道miR-224-5p影響HepG2細胞脂質攝取與蓄積[21]。本研究中circ-SFMBT2下調促進了miR-224-5p的表達，而miR-224-5p下調則恢復了肝癌細胞的增殖、遷移；熒光素酶報告實驗也證實circ-SFMBT2可以與miR-224-5p相互作用。

circRNA通過充當ceRNA來調控miRNA和靶基因表達。利用TargetScan推測發現USP3是miR-224-5p作用靶點。本研究中將含有miR-224-5p結合位點的USP3-3′UTR野生型和突變體序列構建到了熒光素報告載體上，和miR-224-5p過表達mimic的片段一起轉染到293T細胞中，結果顯示轉染野生型USP3-3′UTR和miR-224-5p mimic的熒光活力降低，說明USP3-3′UTR和miR-224-5p之間存在靶向作用關系。同時根據研究報道，USP3可能作為一種致癌基因，促進多種類型癌癥的進展[22]，比如USP3基因敲除對乳腺癌細胞體外增殖和體內成瘤的具有抑制作用；USP3通過去泛素化可促進胃癌細胞遷移和侵襲；USP3可影響胃癌患者的預后[23]。在干擾circ-SFMBT2或過表達miR-224-5p條件下，過表達USP3可以恢復肝癌細胞的遷移和增殖能力，有研究發現海綿狀 miR-224下調USP3作為競爭性內源性 RNA 促進大腸癌轉移[24]。這與本次生物學分析和靶向實驗結果相似。

綜上，circ-SFMBT2可通過靶向miR-224-5p/USP3軸來調控肝癌細胞HepG2的增殖和遷移，下調circ-SFMBT2可抑制肝癌細胞HepG2的增殖和遷移能力，提示circ-SFMBT2是一個潛在的肝癌防治靶點，因此需要對circ-SFMBT2/miR-224-5p/USP3軸進行進一步的研究，可為開發新的肝癌治療策略提供基礎。