不同秸稈還田模式土壤微生物多樣性分析

楊冬靜,謝逸萍,張成玲,馬居奎,唐 偉,陳晶偉,孫厚俊

(江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所/農業農村部 甘薯生物學與遺傳育種重點實驗室,江蘇 徐州 221131)

隨著農業生產的發展,農作物秸稈數量逐漸增多,但農作物秸稈作為生活燃料的用量隨農村生活水平的提高而逐漸減少,且長期以來對農作物秸稈沒有形成專業化、產業化的處理模式而使其被充分利用,大量秸稈在田間地頭被就地焚燒,由此造成資源浪費和環境的重度污染,嚴重威脅著農業的可持續發展。秸稈還田既可充分利用秸稈資源,又可減輕焚燒秸稈對生態環境的負面影響,是發展有機可持續農業的有效途徑[1,2]。已有的研究表明,還田后的秸稈腐解對于促進作物生長、改善和提高土壤質量具有重要作用[3]。曹志平等的研究表明還田秸稈的腐解液可以對病原菌產生化感作用，從而減輕下茬作物病害的發生[4,5]；但李洪林等研究發現秸稈還田可以促進病原菌的積累,增強連作障礙[6,7]。此外,Yu等研究發現,秸稈還田提高了土壤微生物的數量和活性[8],而土壤微生物數量及活性的提高又加速了秸稈的腐解[9],表明秸稈還田與土壤微生物之間是相互促進相互影響的。

采用傳統的微生物分離方法分離出的土壤微生物種類只占土壤微生物種類總數的0.1%～1.0%[10]。采用高通量測序技術方法能夠更加全面地反映土壤微生物的組成情況,故該方法在微生物群落多樣性研究中得到了越來越廣泛的應用。本文以江蘇省農業科學院稻麥輪作模式下紋枯病發生消長規律試驗為依托,采用高通量測序的方法,對旋耕條件下不同秸稈還田方式的麥田土壤微生物多樣性進行了研究,旨在為通過優化秸稈還田方式來調節土壤微生態系統和提高作物產量等提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集和處理

土壤樣品于2019年5月13日采自江蘇省泗洪縣石集鎮稻米文化館秸稈還田試驗地,統一采用旋耕方式，設置4種秸稈還田方式處理：處理A，稻麥秸稈均不還田(命名為Sample1);處理B，稻麥秸稈全量還田(命名為Sample2);處理C，水稻秸稈全量還田(命名為Sample3);處理D，小麥秸稈全量還田(命名為Sample4)。采用5點取樣法,采集土層深度0～5.0 cm的表層土壤,晃動震落小麥根部松散的土壤后,使用無菌刷子從根部收集殘留土壤,將同一樣方5點取樣的土壤樣本等量混勻作為1個樣品；每種還田方式處理設置3個重復,共12份土壤樣品,分別編號為Sample1-R1、Sample1-R2、Sample1-R3、Sample2-R1、Sample2-R2、Sample2-R3、Sample3-R1、Sample3-R2、Sample3-R3、Sample4-R1、Sample4-R2和Sample4-R3。將采集好的土壤樣品置于冰上運輸至實驗室,經液氮速凍后,置于-80 ℃冰箱保存或采用干冰寄送至鎮江蔚綠生物科技有限公司進行測序。

1.2 土壤微生物的測序

利用CTAB法抽提土壤基因組的DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。將純化的DNA進行PCR擴增,將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測；使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(為AXYGEN公司的產品)切膠回收PCR產物,用Tris_HCl洗脫后采用2%瓊脂糖電泳檢測回收的PCR產物。采用Truseq DNA kit (為美國Illumina公司的產品)進行文庫構建,用Illumina PE250測序平臺檢測16S區,擴增引物序列515F為5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′；907R為5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。真菌ITS擴增引物序列ITS1F為5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS2R為5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

1.3 生物信息分析流程

對經Illumina PE測序得到的PE reads,首先根據overlap關系進行拼接,同時對序列質量進行質控和過濾；在區分樣本后進行OTU (Operational Taxonomic Unit)聚類分析和物種分類學分析；基于OTU聚類分析結果,可以對OTU進行多種多樣性指數的分析以及對測序深度進行檢測。基于分類學信息,可以在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。利用基因序列分類單元OTU指數和Chao指數表征群落中物種的數量,利用Shannon指數、Simpson指數綜合評估群落中物種的豐富度和均勻度，采用主成分分析方法分析樣本間OTU的相似性。

2 結果與分析

2.1 土壤樣品細菌測序結果及測序深度評估

對12個土壤樣品細菌的16S片段進行測序,經過優化過濾低質量序列,共得到586423條優質序列,平均長度為376.48 bp(表1)。

表1 測序數據的統計分析結果

2.2 土壤樣品中細菌群落豐度與α多樣性分析

隨著序列數的增大,4個處理的細菌稀釋曲線均基本趨于平緩,說明測序數據量漸進合理,更多的數據量只會產生少量新的物種(OTUs)。

供試土壤樣品序列經拆分、去冗余后，對獲得的高質量序列在97%的相似度下進行歸類和OTU劃分,4個還田方式處理一共獲得了4699個OTUs,平均分別獲得了2952、2831、3109、2772個OTUs；與處理A相比,處理C的平均OTU數明顯增加,表明水稻秸稈還田提高了土壤細菌的多樣性；但是對各組處理數據進行分析，發現群落的均勻度不夠。采用體現群落豐富度的Chao指數、Shannon指數和Simpson指數以及表征群落覆蓋度的Coverage指數進行群落的α多樣性分析，結果見表2。從表2可以看出,處理B和處理C各重復的Shannon指數均高于處理A,表明與稻麥秸稈均不還田相比,稻麥秸稈全量還田和水稻秸稈全量還田均對土壤中細菌多樣性的促進作用較強,但各處理間數據無顯著性差異;與處理A相比,處理D的Shannon指數未見明顯升高,說明小麥秸稈還田對土壤中細菌多樣性的促進作用不明顯。

表2 土壤細菌測序及α多樣性分析結果

2.3 土壤樣品中細菌群落結構組分分析

在不同秸稈還田方式下根圍土壤細菌門水平的優勢菌群包括變形桿菌門Proteobacteria、綠彎菌門Chloroflexi、放線菌門Actinobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、浮霉菌門Planctomycetes、硝化螺旋菌門Nitrospirae、疣微菌門Verrucomicrobia等9個門(圖1A)。在所有樣品中,變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度最高；在4種還田方式下變形菌門的豐度平均值分別為32.6%、33.6%、33.5%和34.2%；與稻麥秸稈均不還田的對照相比,在其他幾種秸稈還田方式下變形菌門的豐度均有所提高,但在處理間無顯著性差異;門水平的其他幾種優勢菌群也有所變化,但是在處理間均無顯著性差異。

在不同秸稈還田方式下根圍土壤細菌屬水平的群落優勢菌群包括厭氧繩菌屬Anaerolineaceae_uncultured、Subgroup6_norank、SC-I-84_norank、芽單胞菌屬Gemmatimonas、KD4-96_norank、Gemmatimonadaceae_uncultured、Gaiellales_norank、Nitrosomonadaceae_uncultured、Arenimonas、Mucilaginibacter、類諾卡氏屬Nocardioides、羅思河小桿菌屬Rhodanobacter、鏈霉菌屬Streptomyces、Blastocatellaceae (Subgroup4)_uncultured、藤黃單胞菌屬Luteimonas、浮霉菌屬Planctomycetaceae_uncultured、馬賽菌屬Massilia、Tepidisphaeraceae_norank、Anaerolinea、Subgroup7_norank、Humibacillus、Marmoricola、Comamonadaceae_uncultured、C0119_norank、Bryobacter、Xanthomonadales Incertae Sedis_uncultured等26個屬(圖1B),其中,7個屬因在分類學數據庫分類學譜系的中間等級,沒有科學名稱,所以用norank作為標記。在26個優勢屬中,4個處理下厭氧繩菌屬Anaerolineaceae_uncultured的豐度最高,分別為8.3%、7.7%、7.4%和7.9%；與不還田對照相比,3種不同秸稈還田方式下厭氧繩菌屬的豐度有所降低,但無顯著性差異。優勢屬分析結果表明,在不同秸稈還田方式下其他優勢細菌屬水平在一定程度上發生了變化。

圖1 4種秸稈還田方式下根圍土壤細菌門水平和屬水平的群落豐度

2.4 4種還田方式下根圍土壤細菌群落的β多樣性分析

對4種秸稈還田方式下麥田土壤中細菌OTU的組成進行主成分分析,從圖2可以看出,稻麥秸稈均不還田的空白對照與稻麥秸稈全量還田、水稻秸稈全量還田以及小麥秸稈全量還田處理之間的距離較遠,說明在不還田和還田處理間土壤細菌OTU組成的差異較大,細菌群落結構也差異較大。而在3個秸稈還田方式處理之間的距離較近,說明在秸稈還田下土壤細菌OTU組成的差異較小,細菌群落結構也相近。

圖2 在4種秸稈還田方式下麥田土壤中細菌OTU組成的主成分分析結果

2.5 4種秸稈還田方式下根圍土壤細菌群落組成及差異物種

差異物種分析結果(圖3和表3)表明：稻麥秸稈均不還田對照組Sample1的差異物種為放線菌目Gaiellales、藍細菌Cyanobacteria、鉻還原間孢囊菌屬Intrasporangium等14個物種,其中放線菌目Gaiellales的豐度最高，為4.41%；在稻麥秸稈全量還田處理下差異物種為Longimicrobia綱、Longimicrobiales目、Londimicrobiaceae科等20個物種,其中Longimicrobia綱的豐度最高，為3.76%;在水稻秸稈全量還田處理下差異物種為Rhodospirillales紅螺菌目、Rhodosppirillaceae紅螺菌科、Inquilinus屬等15個物種,其中Rhodospirillales的豐度最高，為4.37%;在小麥秸稈全量還田處理下差異物種有Mucilaginibacter、Cstemulisporaceae、Bacteroidetes_vadinHA17等18個物種,其中Mucilaginibacter屬的豐度最高，為4.21%;在4種不同秸稈還田方式下細菌群落的差異物種豐度為1.51%～4.84%。

圖3 在4種還田方式下根圍土壤優勢細菌及其豐度

表3 在4種還田方式下根圍土壤中顯著性差異細菌的LDA分值

續表3：

2.6 土壤樣品真菌測序結果及測序深度評估

對12個土壤樣品真菌的ITS片段進行測序,經過優化過濾低質量序列,共得到了553719條優質序列,平均長度為255.66 bp(表4)。

表4 測序數據統計分析結果

2.7 土壤樣品中真菌群落豐度與α多樣性分析

隨著序列數的增大,在4種秸稈還田方式下的土壤真菌稀釋曲線均基本趨于平緩,說明測序數據量漸進合理。供試土壤樣品序列經拆分、去冗余后對獲得的高質量序列在97%的相似度下進行歸類和OTU劃分,4個還田方式處理一共獲得了1674個OTUs,處理A、B、C、D平均分別獲得了572、558、498、699個OTUs(表5)。與處理A相比,處理D的OTU數量提高了,相應地其Shannon指數和Simpson指數也提高了,表明麥秸還田提高了土壤真菌的多樣性。其他兩種還田方式處理也在一定程度上改變了土壤真菌的多樣性。

表5 土壤樣品真菌測序及α多樣性分析結果

2.8 土壤樣品中真菌群落結構組分分析

在不同秸稈還田方式下根圍土壤真菌門水平的主要類群為Fungi_norank、子囊菌門Ascomycota、擔子菌門Basidiomycota、Unclassified、毛霉門Mucoromycota,其中有大量未知真菌的豐度值在43.5%～48.7%;其次是子囊菌門真菌,其豐度值為31.4%～34.6%。

在不同秸稈還田方式下根圍土壤真菌屬水平的主要類群為Fungi_norank、Bolbitiaceae_norank、葡萄孢屬Botrytis、Unclassified、鏈格孢屬Alternaria、Apodus、Paraglomerales_norank、青霉屬Penicillium、 黃絲曲霉屬Talaromyces、帚枝霉屬Sarocladium、子囊菌屬Ascomycota_norank、線黑粉酵母屬Filobasidium、小羊蹄菌屬Microdochium、附球菌屬Epicoccum、鐮刀菌屬Fusarium、Tomentellopsis、Hypholoma屬、擲孢酵母屬Sporobolomyces、芽枝霉屬Cladosporium、Basidiomycota_norank、Lasiosphaeriaceae_norank、曲霉屬Aspergillus、絲枝霉屬Aphanocladium、球腔菌屬Phaeosphaeria、木霉屬Trichoderma、黑孢屬Nigrospora、Simplicillium、旋孢腔菌屬Cochliobolus等28個屬(圖4)。

圖4 在4種秸稈還田方式下土壤根圍真菌門水平和屬水平的群落豐度

2.9 在4種秸稈還田方式下根圍土壤真菌群落的β多樣性分析

對4種秸稈還田方式下麥田土壤中真菌OTU的組成進行主成分分析,從圖5可以看出,處理A與處理B、處理C間的距離較近,說明土壤真菌OTU組成相近,真菌群落結構也相近;而處理D與其他3個處理間的距離較遠,說明土壤真菌OTU組成差異較大,真菌群落結構差異也較大。

圖5 在4種秸稈還田模式下麥田土壤中真菌OTU主成分分析結果

2.10 在4種秸稈還田方式下根圍土壤真菌群落組成及差異物種

從圖6可以看出,在稻麥秸稈均不還田的對照土壤中真菌有枝孢屬Cladosporium、煤炱菌科Cladosporiaceae、小毛菌屬Hirsutella等14個差異物種,其中枝孢屬的豐度最高,為4.12%;在稻麥秸稈全量還田的土壤中真菌有田頭菇屬Agrocybe、蠟蚧菌屬Lecanicilliun、葡萄座腔菌科Botryosphaeriales等6個差異物種,其中田頭菇屬的豐度最高,為3.5%;在水稻秸稈全量還田的土壤中真菌有糞殼菌綱Sordariomycetes、糞殼菌目Sordariales和毛球殼科Lasiosphaeriaceae等15個差異物種,其中糞殼菌綱的豐度值最高,為5.19%；在小麥秸稈全量還田的土壤中真菌有髮菌科Trichocomaceae、黃絲曲霉屬Talaromyces、Striatibotrys屬等3個差異物種,其中髮菌科的豐度值最高，為4.63%(表6)。

表6 在4種秸稈還田方式下根圍土壤中顯著性差異真菌的LDA分值

圖6 在4種秸稈還田方式下根圍土壤優勢真菌種類及差異物種

3 小結與討論

土壤微生物的多樣性和群落結構可以在一定程度上反映農田生態系統的基本情況。保持土壤微生物群落多樣性及其驅動下的生態過程多樣性是農業生產賴以生存的基礎[11]。在秸稈還田條件下土壤中微生物群落結構變化的研究還不夠系統。一般認為長期保護性耕作(免耕、少耕和秸稈還田等)能改善微生物的群落結構,提高土壤微生物的多樣性[12,13],但也有部分研究結果指出短期耕作并未影響微生物的群落結構和多樣性[14,16]。

本研究的土壤細菌多樣性分析結果表明：在4種還田方式下變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度最高；與稻麥秸稈均不還田的對照相比,其他幾種秸稈還田方式下變形菌門的豐度均有所提高,門水平的其他幾種優勢菌群也有所變化；在4種還田方式下,屬水平的共有26個優勢菌群,其中厭氧繩菌屬Anaerolineaceae_uncultured的豐度最高；與不還田對照相比,3種秸稈還田方式下厭氧繩菌屬的豐度有所降低,屬水平的其他優勢菌群也在一定程度上發生了變化,但這些變化均無顯著性差異。主成分分析結果表明：稻麥秸稈均不還田的對照與3種秸稈還田方式處理間的距離較遠,說明還田可以在一定程度上改變土壤細菌的群落結構；在不同處理之間存在14～20種顯著差異性細菌物種。

本文的土壤真菌多樣性分析結果表明：麥秸還田提高了土壤真菌的多樣性,其他兩種還田方式也在一定程度上改變了土壤真菌的多樣性；在4種還田方式下真菌門水平的優勢菌群包括子囊菌門、擔子菌門、毛霉門和一些未分類和未知真菌,屬水平的優勢菌群共有28種。主成分分析表明：小麥秸稈全量還田對土壤真菌群落結構的影響較大,在不同還田方式處理間存在3～14種顯著差異性物種。在本研究中,4種秸稈還田方式從2017年秋季開始實施,至2019年5月小麥收獲前期采集土樣,歷時近2年,屬于短期不同秸稈還田模式下的土壤微生物多樣性研究,本研究結果表明不同秸稈還田方式改變了土壤中細菌和真菌的群落結構和差異物種,說明秸稈還田在一定程度上改變了土壤微生物的多樣性、菌群的相對豐度以及差異物種,但是由于秸稈還田時間較短,在各處理間未見顯著性差異,這與Petersen等學者[14,15]的研究結果相符。鑒于秸稈還田對土壤微生物多樣性影響的復雜性,今后還需要進一步開展該方面的長期定位試驗。