環境水樣中總磷分析方法及儀器的研究進展

許 金，袁東星，王 婷，陳洛丹

(1.廈門大學 環境與生態學院，福建 廈門 361102；2.桂林電子科技大學 教學實踐部，廣西 桂林 541004)

磷是生物不可或缺的營養元素之一，是基本生化物質的重要組成部分。作為生態系統的主要限制性因子[1]，磷直接參與或間接控制了許多其他元素的生物地球化學循環[2]。

1 水體中的總磷

1.1 磷的存在形態與總磷定義

水體中所有形態磷的總和稱為總磷(TP)，可分為4類：溶解態無機磷(DIP)、溶解態有機磷(DOP)、顆粒態無機磷(PIP)和顆粒態有機磷(POP)。根據操作過程定義[3]，水體中能通過孔徑為0.45 μm濾膜的磷稱為總溶解態磷(TDP)，其包括DOP和DIP；被濾膜截留的POP和PIP為總顆粒態磷(TPP)。

根據化學反應對總磷進行劃分[4]，水樣未經過濾直接使用標準磷鉬藍(PMB)分光光度法測得的磷為總活性磷(TRP)；添加硫酸水解后，經PMB法測定的磷包括TRP和總可酸解磷(TASP)，總磷扣除這部分磷即為總有機磷(TOP)。水樣經過濾后，使用PMB法測定的磷為可溶性活性磷(SRP)，其余部分為可溶性非反應性磷(SNP)。水中SRP主要由DIP組成，在遠離大陸的遠洋海域，一般認為SRP濃度近似等于DIP濃度；水中SNP可通過TDP扣除SRP獲得。水樣中磷的分類見圖1。

圖1 根據操作定義和化學反應的水樣中磷的分類Fig.1 Operational and chemical classification of phosphorus in water samples

1.2 地表水中的總磷

近幾十年，隨著工業、農業及城市化的發展，氮、磷等營養元素過量輸入天然水體，導致水體富營養化、生態系統退化、有害藻類大量繁殖以及水域底部缺氧，造成嚴重的水環境問題[5-6]。2000年，我國七大重點流域地表水劣Ⅴ類占13.8%，主要淡水湖泊的富營養化問題突出，總氮、總磷及高錳酸鹽指數為主要污染指標[7]；至2010年，全國地表水污染持續加重，劣Ⅴ類上升至16.4%，26個國控重點湖泊(水庫)中劣Ⅴ類達10個(38.5%)，地表水的主要污染指標為總氮和總磷[8]；截至2020年12月，國內主要流域、湖泊及水庫的水生生態系統得到有效恢復，1 940個水質斷面中劣Ⅴ類斷面降至1.0%，主要污染指標為化學需氧量、高錳酸鹽指數和總磷[9]。由我國近20年來的水環境質量報告可知，總磷一直是地表水的主要污染指標。另有研究表明，地表水體富營養化的發生率和嚴重程度與水體的徑流量、水深、濁度、溫度、光照情況以及碳、氮、硅、磷等元素的含量和比例有關，而總磷濃度是最關鍵的因素[10]。

1.3 海水中的總磷

在海洋環境中，DIP是最大的溶解磷庫，直接影響著浮游植物的生長、豐度、分布和多樣性[11]。在某些海域，如北大西洋的西部海域[12]和東地中海[13]，DIP已成為初級生產力的最終限制性因素。DIP還可能影響海洋氮儲庫的收支平衡[14]。海水中DOP大致分為兩大類有機化合物：含C-O-P鍵的磷酸酯和含C-P鍵的膦酸酯[15]。由于DOP的復雜性和當前TP、TDP測定方法的局限性，DOP的動力學過程、對海洋生態系統和初級生產力的詳細貢獻等尚不明確。

1.4 工業用水中的總磷

隨著工業生產的迅速發展，工業用水量也日益增加。據統計，2005～2019年每年我國工業用水量占總用水量的20.2%～24.1%[16]，是除農業以外最大的用水行業。在工業用水中，循環冷卻水用水量最大[17]。冷卻水在循環使用過程中不斷濃縮，礦物質濃度升高，易引起冷卻系統及設備管道結垢、腐蝕[18]。目前最常用的處理方法是在水中添加一定濃度的緩蝕阻垢劑，以阻止不溶性沉淀物(水垢)的形成，減緩管道和設備的結垢及腐蝕[19]。磷系緩蝕阻垢劑，如羥基乙叉二膦酸、胺基三甲叉膦酸和膦酰基丁烷三羧酸等有機膦酸，在國內外工業領域是應用范圍最廣、防腐效果最好的一類水處理劑[20-21]。在工業領域，通常以水樣中總磷濃度間接反映循環冷卻水中的有機膦酸濃度。

2 總磷的主要分析方法

水體中總磷包含溶于水及附著于細菌、膠體、浮游動植物等固體顆粒表面的各種形態磷，即TP=DIP+DOP+PIP+POP。因此，總磷測定通常分兩步進行：①使用某種消解方法將水樣中各種不同形態的磷轉化為可被檢測的磷酸鹽；②測定消解后樣品中的磷酸鹽濃度。

2.1 總磷的主要消解方法

2.1.1硫酸-硝酸消解法硫酸-硝酸消解法是美國水和廢水分析標準[22]建議的消解方法之一。Kovar等[23]指出，在足夠長的消解時間下，硫酸-硝酸消解法可將幾乎所有形式的含磷化合物轉化為磷酸鹽。但該方法存在試劑空白較高、樣品間易交叉污染和重現性差等問題[24]。此外，該方法操作復雜，加熱的消解液可能會從凱氏燒瓶中逸出，造成一定安全隱患。因此，硫酸-硝酸消解法近年來應用和相關研究較少。

2.1.2干法灰化法Solórzano等[25]將常用于沉積物總磷測定的干法灰化法[26]改進為硫酸鎂-干法灰化-鹽酸消解法，用于分析地表水中的總磷。該法消解效率較高，15種不同種類的含磷化合物回收率均在95%～103%之間。由于該法需對樣品進行干燥、灰化等處理，多被用于測定水體的TPP濃度[27-28]。Labry等[29]詳細論述了河口和沿海海域樣品中有機和無機顆粒態磷的幾種常用消解方法，列舉大量證據表明Solórzano等人改進的干法灰化法是水體TPP測定的最佳方法。但該法操作較繁瑣。

2.1.3微波輔助消解法微波輔助消解法是近年發展起來的樣品前處理方法，其優點是樣品消解效率高[30]。Maher等[31]比較了微波輔助消解和高溫高壓消解在測定湖泊渾濁水樣中總磷的應用，兩種方法的結果無顯著差異，但前者所需的溫度較低，時間較短。此外，微波輔助消解可使水樣在相對不高的壓力下加熱至較高溫度，有利于構建常壓型在線快速消解器[32]。Almeida等[33]將家用微波爐改裝為微波在線消解器，結合多注射泵流動分析技術和分光光度法建立了水樣中總磷的在線分析系統，樣品通量可達12樣/h，并成功用于生活廢水中總磷的測定。微波輔助消解法已被確立為一種常規且完善的樣品制備方法[34]，但需要專門的微波發生裝置，體積大、功耗高，較難在現場應用。

2.1.4過硫酸鉀-高溫高壓消解法Menzel等[35]于1965年首次提出過硫酸鉀-高溫高壓消解法，其操作簡單、消解快速、重現性好，且全程密封，可最大限度地減少樣品間交叉污染[36]。該方法已被列為我國廢水、地表水和海水等各類水樣總磷實驗室測定的國家標準消解方法[37-38]，同時也是美國公共衛生協會[22]和環境保護局[39]推薦的樣品前處理方法。根據消解試劑的酸堿性，過硫酸鉀-高溫高壓消解法分為酸性法、中性法和堿性法。

Gales等[40]開發的酸性法已被美國環境保護局[39]采納，廣泛應用于降雨[41]、土壤徑流[42]、湖泊及河流[43-44]等地表水樣品的總磷監測。Koroleff[45]指出，若先將樣品酸化，消解劑過硫酸鉀的體積分數可從1%降至0.3%。但酸性法的樣品消解后pH值降低，不利于隨后的PMB顯色反應[46]。因此，研究者建議，使用PMB分光光度法測定消解后的總磷時有必要調節樣品pH值[47-48]。

中性法是我國總磷測定標準方法[37-38]推薦的消解法，其可避免酸性法對PMB顯色的影響。但由于縮聚磷酸鹽通常需在酸性條件下經較長時間氧化才能水解為正磷酸鹽，因此縮聚磷酸鹽在中性法下的消解效率較低[36]，可能使水體總磷濃度被低估[49]。

2.1.5UV光氧化法UV光氧化是一種新興消解技術。UV-C光譜區域(220～290 nm)的輻射能破壞化學鍵，常被用于殺菌消毒和光氧化[52]。UV光氧化效率依賴于產生的強氧化自由基數量[53]，可加入化學氧化劑作為自由基發生劑，如過氧化氫、臭氧、過硫酸鹽、Fenton試劑等，以提高光氧化效率。

UV光氧化法易結合流動分析技術構成在線消解器，實現快速、實時、在線的樣品消解。Tong等[54]提出了一種總磷分析的熱輔助光催化消解法，以納米二氧化鈦薄膜為光催化劑，無需添加化學氧化劑，僅通過UV-A發光二極管陣列和微型加熱器完成樣品在線消解。UV光氧化法無法消解縮聚磷酸鹽[53]。在測定水樣總磷時，上述特點可能導致總磷濃度的低估。但在僅需測定水樣DOP時，其他消解方法會同時消解縮聚磷酸鹽而導致DOP的高估，UV光氧化法可避免此不足。

上述消解方法及其優缺點分析匯總于表1。其中，過硫酸鉀-高溫高壓消解法雖需專屬裝置，但因消解能力強、效率高、操作簡單、可同時處理多個樣品，且擁有酸性法、中性法和堿性法以適用于不同類型水樣等優點，成為目前國內外本領域的標準方法[22,37-39]。

表1 水樣總磷的主要消解方法匯總Table 1 Summary of digestion methods for total phosphorus in water samples

2.2 磷酸鹽的主要分析方法

目前，已有眾多分析方法用于測定水樣中磷酸鹽，包括電化學法、化學發光(CL)法、PMB分光光度法、磷釩鉬黃(VMP)分光光度法等[55]。

2.2.1電化學法諸多研究者已報道采用各種電極和相應的電化學技術檢測水溶液中的磷酸根離子[56-57]。離子選擇電極(ISE)是最早和最簡單的磷酸鹽電化學檢測的傳感器之一[58]，主要有液膜電極和固體膜電極。固體膜ISE的響應速度、抗干擾性能及使用壽命優于液膜ISE。最近，Pang等[59]報道了一種Co-Fe2+合金涂層的磷酸鹽微型印刷電極，其線性范圍較寬，檢出限(LOD)為2.14 μmol/L，穩定性良好(≥16 d)，可用于地表水中磷酸鹽的在線測定。相比ISE，伏安法和安培法傳感器的應用受到各種困擾。近年，基于酶的安培傳感器在生物醫學應用中表現良好，但在環境領域中的適用性和耐用性有待驗證[60]。電極微型化和納米結構化給ISE帶來了新進展，電容或阻抗法的使用也為檢測nmol/L級痕量磷酸鹽提供了新的可能。

2.2.2化學發光法CL法的靈敏度和線性范圍等分析性能通常優于分光光度法[61]。魯米諾CL反應體系用于測定水中磷酸鹽的方法分為兩類：①直接測定法，利用磷鉬黃雜多酸與魯米諾在堿性條件下反應，直接測定磷酸鹽；②間接測定法，先利用酶促反應與磷酸鹽形成過氧化氫，過氧化氫再與魯米諾發生CL反應。Yaqoob等[62]基于直接測定法和流動分析技術開發了一種簡單快速的流動注射CL法，樣品通量達180樣/h，LOD低至1 nmol/L；Liang等[63]建立了在線固相萃取-魯米諾CL法，并成功應用于海水中痕量磷酸鹽的測定。相較其他分子光譜法，CL法因無需光源和光譜解析系統而更加簡單經濟，且易與流動分析技術結合。

2.2.3PMB分光光度法PMB分光光度法是測定磷酸鹽的最經典、應用最廣泛的方法。該方法涉及的化學反應過程如式(1)、(2)所示。首先，磷酸鹽與酸性鉬酸鹽反應，生成磷鉬黃雜多酸，其隨后被還原劑還原為PMB[46]。

(1)

H3PO4(MoO3)12+Reductant → [H4PMo(Ⅵ)8Mo(Ⅴ)4O40]3-(PMB)

(2)

多種不同的酸(例如高氯酸、鹽酸、硫酸)和還原劑(例如抗壞血酸、氯化亞錫、硫酸肼、對苯二酚)被分別用于該反應，從而建立了產物吸收光譜有異的系列PMB方法[46]。其中，Murphy等[64]報道的方法使用最廣。其以硫酸為介質，在銻鹽Sb(Ⅲ)存在下以抗壞血酸將磷鉬黃雜多酸還原為PMB，于最大波長880 nm處測定吸光度。該法對水樣鹽度的敏感性低于其他方法，且顯色過程基本不受溫度影響，已成為測定地表水、海水中磷酸鹽的首選方法。

以氯化亞錫為還原劑的PMB法也較為廣泛使用，特別是用于地表水磷酸鹽分析[65]。該法相較上述抗壞血酸法，反應速率更快、PMB摩爾吸光系數更大，且能在可見光區(700 nm)測定，但受氯離子干擾較大，在海水中的靈敏度比在淡水中約低15%，精密度也有所下降[65]。

傳統PMB法的LOD通常在μmol/L水平，如采用抗壞血酸和氯化亞錫為還原劑的PMB法LOD分別約為0.3、0.1 μmol/L[22]，不足以測定低營養或寡營養水體中的磷酸鹽。為提高PMB法的靈敏度，研究者將其與其他富集萃取技術相結合。其中，固相萃取法因濃縮倍數大、易于與流動分析結合實現自動化而備受關注。Ma等[66]結合固相萃取和流動分析建立了海水中痕量活性磷的自動分析方法，LOD降至1 nmol/L，并成功應用于南海表層海水的走航測定。近年來，與基于注射泵的流動序批式分析技術結合，該課題組又構建了一種能測量從nmol/L到μmol/L濃度范圍的磷酸鹽便攜式自動分析系統，成功應用于河口和沿海離散樣品分析及定點在線監測[67]。

2.2.4VMP分光光度法VMP分光光度法作為推行的另一標準方法[22]，廣泛應用于地表水、廢水、生活污水等含磷濃度較高的水樣分析。如上述式(1)描述，在酸性介質中，磷酸鹽與鉬酸銨反應生成磷鉬黃雜多酸；若溶液中存在含氧酸鹽(銻酸鹽、鋯酸鹽和釩酸鹽等)，可形成三元雜多酸。VMP三元雜多酸在385 nm的摩爾吸光系數最大，為3.6×103L/mol/cm[68]。形成VMP三元雜多酸的典型反應見式(3)：

H3PO4+(NH4)2MoO4+NH4VO3+H2SO4→P2O5·V2O5·22MoO3·nH2O+(NH4)2SO4+H2O

(3)

雖然VMP方法的LOD不如PMB法，但其對干擾離子的耐受性很強[69]，非常適合監測廢水和受污染水體中的磷酸鹽。可通過改善檢測技術提高VMP法的靈敏度，Neves等[70]結合長光程流通池技術在保持高通量(60樣/h)的前提下將VMP法的LOD降至0.5 μmol/L。

相較于PMB法，VMP法更適用于流動分析系統及現場測定：①VMP法簡單，試劑單一且穩定，存儲穩定期達1年[71]，而PMB法的試劑存儲期通常僅為數周；②PMB產生時會形成細小的沉淀物，可能堵塞分析流路通道[68]，而VMP法無沉淀物生成；③PMB法的藍色絡合物易吸附在管道和流通池的內壁，影響長期測定，而VMP法無此現象。基于以上特點，VMP法在微流控領域備受歡迎[71-73]，尤其是開發長期無人值守的現場測定便攜式儀器時常被采用[74]。

磷酸鹽主要分析方法的優缺點及典型應用見表2。其中，經典的PMB法[64]和VMP法[22]更適用于在線、實時的測定環境，但兩者分別存在試劑穩定性較差和靈敏度較低等缺點。

表2 磷酸鹽的主要分析方法匯總Table 2 Summary of main analytical methods of phosphate

3 總磷的主要分析儀器

3.1 總磷離線分析流程與儀器

總磷的離線分析包括消解和測定兩個步驟，通常在實驗室中進行。在上述眾多的總磷分析方法中，以過硫酸鉀-高溫高壓消解、PMB分光光度法測定的分析方法最為流行，也被多國推行為實驗室總磷離線測定的標準方法[22,37-39]。該法消解效率高，測定方便、簡單，消解和測定相互獨立，可實現離散樣品的批量處理。但高溫高壓消解裝置通常體積龐大，且具有一定操作危險，因此在現場的應用受限。

研究者從消解試劑、消解手段和消解設備等方面入手，開發了諸多改進型總磷離線分析方法。Huang等[75]以常規恒溫烘箱替代高壓滅菌鍋，在亞沸點(90 ℃)溫度下消解樣品16 h，測定結果與標準方法無顯著差異；Ma等[76]使用溶解度高的過硫酸鈉替代過硫酸鉀，并利用家用燒水壺通過沸水浴高溫消解樣品3 h來替代高溫高壓消解，實現了更簡便的總磷離線分析，能較好地滿足特殊場合(如船載、車載)的離線分析需求。

3.2 總磷在線分析儀器

總磷在線分析將消解和測定集為一體，可在環境水體原位或現場應用。總磷在線分析儀常采用流動分析技術，具有操作簡單、易于自動化、樣品通量高、重復性好、試劑和樣品消耗低以及封閉分析管道污染少等優點，自引入分析化學領域后便得到迅速發展。此外，流動分析系統的資源可調度性和組件可擴展性非常強，可根據不同需求自主開發涵蓋各種功能的樣品前處理及分析儀器。

流動式在線消解已被認為是一種有效的總磷快速消解技術[77-78]。Gentle等[79]和Taylor等[80]采用UV-熱誘導過硫酸鉀在線消解法和PMB氯化亞錫還原法，分別研制了便攜式總磷流動在線分析儀和總磷原位自動分析儀，并成功用于地表水和河口總磷的在線和原位觀測。魏康林等[81]采用超聲波輔助Fenton試劑在線消解法和PMB分光光度法，聯合流動序批式分析技術，構建了常溫常壓條件下地表水樣總磷的在線自動分析儀。Xu等[78]以流動分析技術為基礎，結合UV光氧化法與VMP分光光度法，研制了將工業循環冷卻水中有機膦酸在線轉化為總磷并實時監測的UV消解總磷自動分析儀。所研儀器完全自動化，已成功應用于工業循環冷卻水系統現場。

伴隨著半導體技術、微機電系統和納米技術的不斷發展，研究者開發出“芯片式”總磷在線分析系統。Li等[82]基于光流控技術研發了集成高溫消解器和光學檢測的總磷在線實時監測系統，在微芯片上綜合了樣品消解、顯色、分光光度檢測等功能。Jung等[83]集成UV光氧化消解器和光度檢測器，建立了微型總磷在線分析系統，在常溫常壓下實現水樣在線消解，能在較短時間內取得與實驗室高溫高壓法相媲美的數據。

各科學儀器公司基于流動分析技術推出了總磷在線自動監測的商品儀器(見表3)。這些儀器多采用高溫高壓消解法和PMB分光光度法，測定準確、可靠、穩定性好，適用于地表水、市政和工業等領域的監測。但測樣時間長、體積龐大，且因是針對天然水或廢水監測而研制，不宜用于海水。長期進行高溫高壓消解會導致管道接口老化，造成消解池泄漏；而PMB法由于所用的還原劑易被氧化，穩定性差[71]。

表3 一些商用總磷在線分析儀的參數比較Table 3 Comparison of the analytical characteristics of some commercial online TP analyzers

4 總磷分析方法及儀器發展趨勢

綜上所述，總磷的樣品消解方法和測定方法均存在很大的局限性，使得總磷成為常規水質監測中最不易準確定量的參數之一。盡管有越來越多的商品儀器面世，為滿足日益提高、日漸特殊的測定需求，研究者仍不斷努力研究新方法、研制新儀器，推動小型、便攜、快速、自動的水樣總磷測定儀器的發展。

4.1 總磷分析方法的發展趨勢

當前，總磷檢測方法的自動化程度低、樣品消解費時費力、所用儀器龐大昂貴，且大多數不能用于現場或實時在線監測，更難以實現長期觀測。盡管傳統的實驗室離線分析仍是目前總磷的主要分析方法，但在線和現場分析是發展趨勢。而不論是實驗室離線測定還是現場在線測定，總磷分析方法均朝著儀器化、全自動化、樣品通量高、精密度高、線性范圍寬、試劑消耗少的方向發展。此外，發展總磷、總氮同時測定的分析方法也是環境監測領域尤其是水環境監測領域的研究熱點和重點[90-91]。

4.2 總磷分析儀器的發展趨勢

隨著社會經濟和現代科學技術的快速發展，新材料、新器件、新技術、新機理不斷涌現，加工和制造工藝也得到有效改善，共同推動總磷分析儀器及相關技術的持續進步。從科學研究和儀器制造技術的角度看，總磷分析儀器總體向著“落地式-大型臺式-便攜式-芯片式”的方向發展，越來越模塊化、在線化、小型化、自動化和智能化。現場在線總磷分析儀器是準確掌握水體總磷實時情況、及時了解突發性水體污染事件的技術支撐；流動分析技術能節約試劑、提高測定準確度和精度，也是自動化的基礎；自動化和智能化可替代繁重的手工操作，減少人為因素引起的誤差，提高分析結果的可靠性和實時性。