1-萘酚誘導人血清白蛋白和牛血清白蛋白構象的變化

李夢碩，朱亞先，張 勇*

(1.近海海洋環境科學國家重點實驗室，廈門大學 環境與生態學院，福建 廈門 361102；2.廈門大學 化學化工學院 化學系，福建 廈門 361005)

環境中的中低分子量多環芳烴(PAHs)可經呼吸或飲食攝入人體，一部分PAHs在循環系統中被血液中的酶迅速代謝并激活，生成環氧化合物、羥基化PAHs等代謝產物，而這些代謝產物與生物大分子的相互作用可對人體健康產生危害[1-3]。血清白蛋白是人體循環系統中含量最豐富的運輸蛋白，其與PAHs代謝產物的相互作用可調節后者的分布和運輸。因此，血清白蛋白與PAHs代謝產物相互作用的研究備受關注[4-6]。牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)因生產成本低、易于獲取的優點被廣泛用作模式蛋白研究血清白蛋白和外源小分子的相互作用。BSA與人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)晶體結構中的氨基酸序列表現出76%的相似性，但Maity等[7]的研究表明碳納米點-BSA復合物的穩定性較碳納米點-HSA更高，而Bourassa等[8]的研究表明，葉酸-BSA的結合常數較葉酸-HSA的結合常數更高，同一污染物與BSA、HSA的結合作用也存在差異。本課題組對BSA與1-羥基芘(1-Hydroxylpyrene，1-OHPyr)相互作用的研究結果顯示[9]，1-OHPyr-BSA的熒光特征峰與Carmona等[10]的研究結果差異明顯；并利用芘(Pyrene，Pyr)的微環境極性探針性質證實Pyr在HSA、BSA中結合位點的微極性存在差異[4]。Sun等[11]在吸煙人群血液中檢測到大量1-羥基萘(1-Naphthol，1-OHNap)，該物質可嵌入BSA的疏水空腔并形成復合物[5]，但其與HSA、BSA的相互作用與1-OHPyr間的異同尚未見報道。

本文采用穩態熒光光譜、同步熒光光譜、熒光共振能量轉移技術結合分子對接法，考察了1-OHNap與HSA、BSA相互作用的異同。嘗試進一步闡明不能用BSA代替HSA開展相關工作，并藉此為吸煙對人體健康的影響研究提供分子水平的實驗證據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

BSA(>96%)和三羥甲基氨基甲烷(分析純)均購于阿拉丁試劑公司；HSA(≥97%)和1-OHNap(分析純)購自Sigma試劑公司；無水乙醇等其余藥品均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。

QM 8000光譜儀(日本Horiba公司)；J-810圓二色光譜儀(日本Jasco公司)；Five Easy Plus臺式pH計(美國Mettler Toledo公司)；DF-101S恒溫水浴鍋(中國華美公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1熒光發射、同步熒光光譜的測定依次向兩組10 mL棕色比色管中，分別加入100 μL 1.0×10-4mol/L 的HSA、BSA，然后加入不同量的1.0×10-3mol/L 1-OHNap，使其終濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5×10-5mol/L，以0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液定容，搖勻后靜置30 min，待體系達到平衡后分別進行熒光發射、同步熒光光譜測定。熒光光譜儀參數設定：激發、發射狹縫均為5 nm，掃描停留時間為0.05 s，步距為1 nm；測定激發波長為280 nm時，上述體系在290～550 nm范圍內的熒光發射光譜；以及Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時，體系在290～360 nm和300～420 nm范圍內的同步熒光光譜。

1.2.2CD光譜室溫(T=291 K)下，掃描190～250 nm波長范圍內不同濃度1-OHNap與HSA、BSA混合體系中HSA、BSA的CD光譜。CD光譜儀參數設定：掃描速度100 nm/min；響應時間0.2 s；響應波長寬度1 nm。將樣品CD光譜值輸入CDPro軟件，通過SELCON3方法，計算獲得結合1-OHNap后HSA、BSA中各自α-螺旋的占比。

1.2.3分子對接模擬采用Auto Dock4.2.1和 Auto Dock Tools軟件計算1-OHNap分別在HSA、BSA中對接能量最低的構型。對接過程、參數均參考文獻方法[12]。分子對接時選擇的HSA(PDB編號：1AO6)和BSA(PDB編號：4F5S)的晶體結構均由PDB數據庫下載。利用Pymol軟件進行可視化研究并計算最優構型結合口袋處1-OHNap周圍4?范圍內氨基酸的極性和與色氨酸(Tryptophan，Trp)殘基之間的距離。

2 結果與討論

2.1 1-OHNap誘導HSA、BSA構象變化的差異

2.1.1熒光猝滅光譜熒光法是在低濃度、非破壞生理條件下，評估蛋白質二級結構變化的有效檢測手段[13]。如圖1所示，當λex=280 nm時，HSA(335 nm)、BSA(340 nm)的熒光發射強度主要由Trp、酪氨酸(Tyrosine，Tyr)熒光團貢獻，此外，在330～340 nm范圍內的熒光信號均不受1-OHNap(476 nm)熒光信號的干擾。如圖2A所示，當HSA溶液中加入1-OHNap后，HSA在λem=335 nm處的峰由1個變成3個，其位置分別為λem=315 nm、328 nm和340 nm。Bobone等[14]的研究結果表明磷酸鹽緩沖溶液中單獨Trp、Tyr殘基的特征熒光發射峰分別在λem=305 nm和360 nm處。文獻指出BSA特征熒光發射峰的位置、強度與其Trp、Tyr殘基微環境的極性有關[15]。Abou-Zied等[16]的研究表明HSA的構象展開后，其特征熒光發射峰可由1個峰變成位于λem=308 nm和355 nm的兩個。由此可知，HSA與1-OHNap結合后會導致HSA中熒光團Trp、Tyr殘基周圍微環境的極性發生改變，且與1-OHNap的結合作用可誘導HSA構象的變化。Wu等[5]的研究結果表明,1-OHNap以π-π堆積或與BSA分子內氨基酸殘基形成復合物。如圖2B所示，當向BSA體系中加入梯度濃度的1-OHNap后，BSA在340 nm的熒光發射峰呈現出4 nm的紅移，說明BSA中熒光團周圍的極性增加，疏水性減弱。顯然，結合1-OHNap后，HSA的特征熒光光譜較BSA有明顯變化，且1-OHNap誘導HSA構象的變化更顯著。

圖1 HSA(A)、BSA(B)和1-OHNap(C)的熒光發射光譜Fig.1 Fluorescence emission spectra of HSA(A),BSA(B) and 1-OHNap(C)λex=280 nm,Ex./Em.slit=5/5 nm(for 1-OHNap and HSA,BSA);c1-OHNap=5.0×10-6 mol/L;cHSA=cBSA=1.0×10-6 mol/L

2.1.2同步熒光光譜利用同步熒光光譜考察了1-OHNap對1-OHNap-HSA、1-OHNap-BSA體系中HSA、BSA的Trp(Δλ=60 nm)和Tyr(Δλ=15 nm)殘基微環境極性的影響[17]。如圖3A所示，隨著1-OHNap濃度的增加，1-OHNap-HSA體系中HSA Tyr殘基的熒光強度降低,Trp殘基的熒光特征峰紅移。文獻[14]的工作表明,Trp、Tyr殘基特征熒光發射峰的位置會隨溶劑極性的不同而變化。由此可知，加入1-OHNap后，1-OHNap-HSA體系中Trp、Tyr殘基周圍微環境的極性改變。如圖3B所示，隨著1-OHNap濃度的增加，1-OHNap-BSA體系中BSA Tyr、Trp殘基的熒光強度均降低，Trp殘基的熒光特征峰紅移2 nm。因此，加入1-OHNap后，1-OHNap與BSA形成復合物，1-OHNap-BSA體系中Trp殘基周圍微環境的極性增加，疏水性減弱。

2.1.3CD光譜利用CD光譜法定量考察了不同濃度1-OHNap對HSA、BSA二級結構的影響[17]。如圖4A、B所示，210 nm和220 nm兩個負峰表示血清白蛋白中的α-螺旋結構[18]。當向HSA、BSA中各加入等濃度的1-OHNap時，HSA中α-螺旋含量的占比由50.5%降至44.3%，BSA中α-螺旋含量的占比由50.4%降至48.7%。HSA中α-螺旋占比的降幅較BSA更大，說明1-OHNap誘導HSA構象的變化更顯著 。當混合體系中1-OHNap的濃度增至HSA、BSA濃度的2倍和10倍時，HSA、BSA中α-螺旋含量的占比分別為48.7%、45.8%和46.0%、50.3%。由此可見，1-OHNap的加入可改變HSA、BSA的二級結構，這是由1-OHNap與HSA、BSA形成復合物引起的[5]。

2.2 1-OHNap與HSA、BSA結合常數的差異

研究表明，1-OHNap與血清白蛋白的結合作用力以范德華力和氫鍵作用為主[5]。當1-OHNap與HSA、BSA以1∶1結合形成復合物時，利用雙對數方程擬合[19]得到1-OHNap分別與HSA、BSA作用的結合平衡常數(Kb)和結合位點數(n)。如表1所示，1-OHNap-HSA和1-OHNap-BSA體系的Kb值分別為1.49×104L/mol和8.76×103L/mol，有一個數量級的差異。

表1 不同體系的結合常數和結合位點數Table 1 Binding constants and number of binding sites of different systemsT=291 K

2.3 1-OHNap與HSA、BSA結合位點的差異

為進一步從分子水平探究1-OHNap與HSA、BSA形成穩定復合物時結合位點的差異，分別進行HSA、BSA與1-OHNap的分子對接研究。經計算，1-OHNap在HSA、BSA中的最優結合位點分別是ⅡA子域和ⅠB子域，結合自由能分別為-5.47 kJ/mol和-5.61 kJ/mol，表明1-OHNap與HSA、BSA的結合過程均可自發形成。如圖5所示，利用Pymol軟件獲得最優結合位點處1-OHNap與HSA中Trp214(1.26 nm)，BSA中Trp134(1.24 nm)和Trp213(2.77 nm)的距離。結合態1-OHNap在HSA作用位點4?范圍內的非極性氨基酸有Ile264、Ala291、Ala261和Leu238，極性氨基酸有Tyr150，帶正電荷的極性氨基酸有Arg257和His242，帶負電荷的極性氨基酸有Glu292；而1-OHNap在BSA作用位點4?范圍內的非極性氨基酸有Ile141、Pro117、Met184、Ile181，極性氨基酸有Tyr137、Tyr160和Asn 267，帶正電荷的極性氨基酸有Arg185，帶負電荷的極性氨基酸有Glu182，表明ⅠB子域因其不完全疏水而表現出一定極性，與Zhang等[9]發現的1-OHPyr可進入BSA中ⅠB子域的結合位點并導致其周圍氨基酸殘基疏水性降低的結果一致。

圖5 1-OHNap在HSA(A)和BSA(B)中不同結合位點的分子對接圖像Fig.5 Molecular docking images of HSA(A) and BSA(B) with 1-OHNap at different binding sites

2.4 1-OHNap與HSA、BSA中Trp作用距離的差異

為進一步明確1-OHNap分別與HSA、BSA結合位點的差異，根據F?rster能量轉移理論[20]，采用Felix GX 4.1.2軟件計算了1-OHNap分別與HSA、BSA的能量轉移效率(E)和表觀距離(R0)。如圖6所示，1-OHNap的最大吸收峰位于295 nm左右，與HSA、BSA的熒光發射光譜有一定程度的重疊，受體1-OHNap滿足與供體HSA、BSA發生能量轉移的要求。當1-OHNap與HSA、BSA等濃度混合時，1-OHNap與HSA、BSA的E分別為8.7 %和4.7 %，結合位點處的1-OHNap與HSA和BSA中Trp殘基的R0分別為1.53 nm和1.42 nm，與“2.3”中1-OHNap分別與HSA中Trp214(1.26 nm)、BSA中Trp134(1.24 nm)的距離接近，該結論與分子對接的實驗結果一致。

圖6 HSA(A)、BSA(B)的熒光發射光譜與1-OHNap(C)的UV-Vis吸收光譜Fig.6 Fluorescence emission spectra of HSA(A),BSA(B) and UV-Vis spectrum of 1-OHNap(C)

3 結 論

本文通過實驗發現1-OHNap與HSA、BSA相互作用時的結合位點及微環境極性存在差異，且造成的HSA構象的變化更為顯著；低分子量1-OHNap通過π-π堆積或形成復合物作用，對HSA構象的影響高于BSA。進一步說明用BSA代替HSA開展有關PAHs代謝產物與血清白蛋白相互作用機制研究時，血液中的1-OHNap對HSA轉運功能的影響被低估。同時，利用時間分辨熒光光譜和熒光壽命顯微成像技術等方法有望更好地從分子水平全面了解PAHs代謝產物分別與HSA和BSA作用機制的差異。