基于網絡藥理學的藏藥二十五味肺病丸防治新冠病毒肺炎（COVID-19）可行性分析及機制探討＊

李曉朋，史志龍，龔普陽，哈立洋，李彥希，譚 睿，顧 健＊＊

(1.西南民族大學藥學院 成都 610041；2.西南交通大學生命科學與工程學院 成都 610031)

2019年12月以來，由于新型冠狀病毒(SARSCoV-2)導致的急性肺炎(COVID-19)在全世界開始流行，國外如意大利、西班牙、美國、法國等[1]。至2020年3月24日，國外僅意大利，西班牙、美國、法國就分別有63927、35136、46376、16018確診病例，國外累計確診病例為307314，并且呈現出快速增長趨勢。我國累計確診病例為81803，目前疫情基本得到控制，病例主要以境外輸入為主。此次病毒主要靠呼吸道飛沫進行傳播，還可以通過接觸傳播，具有傳播能力迅速并且傳染性強的特點。SARS-CoV-2是目前發現的一種新的冠狀病毒，目前我們對這種全新的病毒的認識還不全面，目前主要采用中醫和西醫進行相關治療，目前無特效治療藥物[2]。COVID-19屬于急性感染性肺炎，感染者最初主要表現為呼吸道癥狀、咳嗽、發熱和呼吸困難等，在較嚴重病例中可能引起肺炎、嚴重急性呼吸綜合征、腎衰竭，嚴重的話還會導致死亡[3]。2020年1月30日，WHO宣布將新型冠狀病毒肺炎(novel coronavirus pneumonia，NCP)疫情列為國際關注的突發公共衛生事件[4]，找到治療新冠肺炎新的治療方法極為重要，迫在眉睫。

藏醫藥是我國民族醫藥的珍寶，它是僅次于中醫藥的一門民族醫藥。在經歷了漫長發展過程中，藏族人民通過與自然和疾病的較量后逐步累積和掌握了治療各種疾病的方法，形成了自己獨特的治病風格；在吸收了中醫藥學、希臘醫藥學、印度醫藥學等醫藥精華的基礎上，創造了自身的理論體系[5]。由病毒導致的傳染病多屬于我國傳統醫學古代“瘟疫”的范疇[6]。對于瘟病而言，藏醫通常稱為瘟熱病，是人們感受穢氣、濁氣后導致的一種急性傳染病。瘟病發病的病因分為內因和外因，內因是赤巴邪，外因是四季氣候異常，環境的五元發生不足、過盛，劇烈運動，飲食問題，或受到驚嚇或悲傷，尤其是接觸或吸入具有的穢氣毒風，瘟邪通過汗孔、鼻孔及人體六門，依次進入培根、赤巴、隆所存在的部位而發病[7]。四味藏木香湯散是醫治瘟熱病的基礎藥，主要成分為藏木香，懸鉤木，寬筋藤和干姜[8]。從首例新冠病毒肺炎逝者尸體解剖報告來看，病毒主要引起深部氣道和肺泡損傷為特征的炎癥反應，與SARS的病理特征非常相似，病變主要還是集中在肺部[9]。肺內感染是由致病菌或病毒感染造成的肺部疾患，包括西醫的急、慢性支氣管炎、氣管炎、急、慢性肺炎等上呼吸道感染疾病，屬中醫咳嗽、痰飲、肺癰、哮喘等范疇。選用藏藥二十五味肺病丸加味治療肺內感染150例，療效較好，總有效率為99.9%[10]。二十五味肺病丸包含四味藏木香湯散中除干姜中的3味藥，由檀香、懸鉤木、藏木香、石灰華、紅花、獐牙菜、沙棘膏、訶子、寬筋藤等25味藥材組成，具有清熱解毒、抗炎、抗病毒、止咳化痰等藥理作用，主要功能為清熱消炎、止咳，同時可以消除肺部相關炎癥，清熱解毒，止咳化痰，對于新型冠狀病毒引起的肺炎可能具有一定的防治作用。

隨著系統生物學和生物信息學等前沿科技的進步、生物醫藥領域數據的迅增以及計算能力與實驗手段的快速進步，中藥方劑的研究已突破單生物學因素和單純實驗手段的限制，使得從“關系—網絡—功能”的角度探索中藥方劑的特色內涵成為可能[11]。網絡藥理學是通過系統生物學的理論對生物系統的網絡分析，選取需要的信號節點進行多靶點藥物分子設計一門學科。網絡藥理學強調對信號通路的多途徑調節從而增強藥物的治療效果，降低藥物的毒副作用[12,13]。本研究擬通過網絡藥理學篩選二十五味肺病丸作用靶點，初步探究二十五味肺病丸關鍵化合物，由于本文研究基礎藥為藏藥大復方，大部分化學成分在數據庫中檢索不到，只有通過文獻挖掘，查詢各藥材的特征化合物，再結合Chemical book數據庫以及TCMSP數據庫進行驗證以保證化學成分結構準確性，局限性可能由于藏藥數據庫不完善，導致本文章所研究的化合物可能不全面，但是本文章選擇的化合物為各藥材特征性化合物，具有一定的代表性。通過CTD數據庫查詢COVID-19作用靶點，找到與二十五味肺病丸共有靶點進行蛋白互作以及GO富集分析和KEGG富集分析來探討二十五味肺病丸防治COVID-19作用機制，為二十五味肺病丸防治新冠病毒肺炎提供相應依據。

1 方法

1.1 二十五味肺病丸中成分收集

由于二十五味肺病丸藏藥組方復雜，其組成成分大多數在中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/)檢索不到，因此根據藥材中化合物的專屬性、類藥性(分子量、生物利用率、口服吸收等參數)以及藥理活性的相關文獻報道并結合Chemical book數據庫(https://www.chemicalbook.com/)和TCMSP數據庫進行確認，確定目標化合物，下載其3D結構并保存為.mol格式。

1.2 目標化合物作用靶點預測

Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)是一種小分子作用靶點預測的數據庫，可以預測小分子化合物的作用靶點，同時給出Uniprot ID及其他化合物相關信息，將得到的目標化合物的三維結構文件導入Swiss Target Prediction數據庫，設置屬性為“Homo sapiens”預測活性成分靶點，并以.csv格式下載文件，篩選(可能性大于5%)靶點蛋白。

1.3 藥材-化合物-靶點構建

將以上收集到的數據制成藥物-化合物和化合物-靶點的Excel表，將其導入Cytoscape軟件中，點擊Tools中的Merge鍵將兩個網絡整合在一起，構建藥材-化合物-靶標網絡，分析化合物和靶點網絡。

1.4 COVID-19與二十五味肺病丸共同靶點基因收集及蛋白互作網絡的構建

運用CTD數據庫(http://ctd.mdibl.org/)查詢與COVID-19疾病相關的靶點基因，通過分析找出與二十五味肺病丸共有的靶點基因并構建化合物-共有靶點-疾病網絡圖進行可視化。將共同基因導入STRING(http：//string-db.org)數據庫中進行蛋白互作分析，以minimum required interaction score為0.4作為篩查標準，選取置信度較高的數據，構建由導入基因所表達產物組成的PPI網絡圖。

1.5 靶點的通路分析

為了進一步分析靶標蛋白基因的功能以及在信號通路中的作用，將以上篩選得到的二十五味肺病丸與COVID-19共同靶點靶點導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)，限定物種為人，進行GO生物學過程富集分析和KEGG信號通路富集分析，將數據下載。運用作圖軟件繪制GO富集條形圖和KEGG通路氣泡圖。

2 結果

2.1 活性化合物的篩選

根據藥材中化合物的專屬性、類藥性并通過TCMSP檢索到檀香、懸鉤木、山柰、紅花、獐牙菜、甘草、藏木香、寬筋藤等19種藥材化合物共38個，收集其MOL ID以及OB%值和DL值(沒有MOL ID的用CAS號代替)，OB值越高通常表示藥物的生物活性越好和類藥性(DL)越好，具體見基本信息見表1。

表1 二十五味肺病丸化合物基本信息表

2.2 藥材-化合物-靶點網絡

藥材-化合物-靶點網絡由1475條邊和476個節點，包含了19種藥材，38個化合物和相應靶點419個(圖1)，靶點基因在圖中用綠色的方框表示，化合物在圖中用藍色的圓圈表示，藥物在圖中用紅色的三角表示(顏色深的表示其在網絡中作用越大)。在圖中每條邊代表藥材與化合物及化合物與靶點相互作用關系。在網絡中，1個節點的度值表示網絡中和節點相連的路線的條數。對網絡圖進行網絡拓撲分析，這些連接化合物或靶點較多的節點在整個網絡中起到樞紐的作用，可能是關鍵的化合物或者靶點。在網絡圖中，許多化合物有相同的作用靶點，同時也有相應的靶點作用于不同的化合物，因此二十五味肺病丸中存在1個化合物與多個靶點作用，同時也存在不同化合物共同作用于同1個靶點的現象。有50%的化合物作用靶點大于20個，有31.5%的化合物作用靶點超過12個。排名靠前的化合物可能為二十五味肺病丸中關鍵化合物，排名前10的化合物分別為MOL000422-山柰酚(Kaempferol)、MOL000098-槲皮素(Quercetin)、MOL000354-異鼠李素(Isorhamnetin)、MOL002083-苜蓿 素(Tricin)、MOL000008-芹 菜 素(Apigenin)、MOL004804-甘草次酸(Glycyrrhetinic acid)、MOL010601-科羅索酸(Corosolic acid)、MOL005559-山楂酸(Maslinic acid)、MOL001996-路路通酸(Betulonic acid)、MOL001002-鞣花酸(Ellagic acid)。從靶點角度而言，由于篩選的為特征性化合物，化合物數量較小導致靶點節點差異性較小，因此選出排名前30的靶點為CA12、CA2、CA7、CA1、CA9、MMP2、CA14、CYP19A1、ADORA2A、AKR1B1、AKR1B10、CA13、ADORA1、ESR2、TERT、ALOX5、CA4、TOP1、PTPN1、AR、ADORA3、CA6、BACE1、CA5A、CA3、MMP3、PTGS2、EGFR、ESR1、AKT1。結合肺病相關通路的靶點蛋白，初步篩選出可能潛在的關鍵靶點為PTGS2、AR、ESR1、AKT1、EGFR。

圖1 二十五味肺病丸藥材-化合物-靶點網絡

2.3 COVID-19與二十五味肺病丸共同靶點基因及蛋白互作網絡

運用CTD數據庫(http://ctd.mdibl.org/)查詢與COVID-19疾病相關的靶點基因472個，與二十五味肺病丸共有靶點基因77個，分別為ESR1、NOS2、PPARG、PTGS2、PPARA、HMGCR、CYP17A1、NR1H4、TLR9等(圖2)。對化合物-共同靶點-疾病網絡進行可視化見圖3，該網絡圖中，綠色代表疾病，藍色代表共有靶點，粉色代表化合物。該網絡中共有112個節點，330條邊，包含了1個疾病、35個化合物和相應靶點77個。將共有靶點輸入到String數據庫中進行檢索，選取minimum required interaction score＞0.4的靶點，進行PPI網絡分析(圖4)，其中各節點代表靶點基因，每條邊代表靶點與靶點之間的相互作用關系，該網絡中含有77個節點，891條邊，平均每個節點有23.1條邊，顏色越深，節點的度值越大(圖4)，說明該節點發揮的作用就越大，作用機制就越復雜。篩選度值排名前30的靶點分別為AKT1、IL6、CASP3、MAPK3、TNF、SRC、EGFR、JUN、MAPK1等，具體信息見圖5，這說明二十五味肺病丸相關靶點是通過復雜的相互作用關系對COVID-19起到相應的防治作用。另外在2.2中分析的關鍵靶點PTGS2、AR、ESR1、AKT1、EGFR除AR外皆在圖5中，這也充分驗證了2.2分析的可靠性。

圖2 二十五味肺病丸與COVID-19共有靶點基因圖

圖3 化合物-共同靶點-疾病網絡圖

圖4 二十五味肺病丸蛋白互作PPI網絡模型圖

圖5 PPI網絡中的關鍵節點

2.4 靶點通路分析

通過DAVID數據庫進行的GO功能富集分析得到339條生物過程條目(BP)，45條細胞組成條目(CC)和81條分子功能條目(MF)結果見圖6。KEGG通路富集分析篩選得到102條信號通路。信號通路中包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、甲型流感、胰腺癌、T細胞受體信號通路等。其中小細胞肺癌通路有AKT1、PTGS2、BCL2L1、NOS2、IKBKB等靶點基因，非小 細 胞 癌 通 路 有AKT1、EGFR、PRKCA、MAPK1、ERBB2等靶點基因，膀胱癌通路有EGFR、MAPK1、MMP9、ERBB2、MAPK3等靶點基因，甲型流感作用通路有AKT1、MAPK1、IL6、TNF、JUN等靶點基因，胰腺癌通路有AKT1、EGFR、MAPK1、ERBB2、MAPK3等靶點基因、T細胞受體信號通路有AKT1、MAPK1、TNF、JUN、GSK3B等靶點基因。選P值較小的25個通路進行可視化(圖7)。

圖6 二十五味肺病丸靶標的GO富集分析

圖7 二十五味肺病丸作用靶點KEGG富集分析的25條通路氣泡圖

3 討論

從COVID-19爆發至今，給廣大人民群眾健康造成的嚴重的威脅。藏醫藥作為我國醫藥學中僅次于中醫藥的一門民族醫藥，在藏族人民長期與疾病斗爭中累積和掌握了豐富的自我保健及治療各種疾病的方法。本研究以藏藥二十五味肺病丸為基礎，主要是通過查閱文獻中該藥物藥材的特征性化合物成分從而進行了相關分析，利用網絡藥理學的方法探討藏藥二十五味肺病丸防治COVID-19的可行性分析，從而為二十五味肺病丸防治COVID-19提供相應依據，同時老藥新用可以減少新藥研究臨床試驗所耗費的時間，為早日戰勝疫情提供相應的幫助。

本研究采用網絡藥理學方法對二十五味肺病丸組方藥材檀香、懸鉤木、藏木香、紅花、獐牙菜、沙棘膏、訶子、寬筋藤等化合物及靶標進行網絡分析，從網絡藥理學分析結果可知山柰酚(Kaempferol)，槲皮素(Quercetin)、異鼠李素(Isorhamnetin)、苜蓿素(Tricin)、芹菜素(Apigenin)、甘草次酸(Glycyrrhetinic acid)、科羅索酸(Corosolic acid)、山楂酸(Maslinic acid)、路路通酸(Betulonic acid)、鞣花酸(Ellagic acid)等化合物可能為二十五味肺病丸中的關鍵化合物，可能對COVID-19防治起到一定作用。有文獻研究表明山柰酚對急性肺損傷[14]、乳腺炎[15]、關節炎[16]等炎癥疾病可能有潛在的治療效果。槲皮素作為一種自然界天然存在的黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用，其抗炎作用主要通過抑制炎癥因子的表達產生抗炎效果[17]。異鼠李素作為黃酮類化合物，具有抗炎，抗病毒等多種作用[18]。苜蓿素(Tricin)為黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗癌等作用[19]。芹菜素為黃酮類化合物，具有抗病毒、抗真菌、減肥、抗寄生蟲、免疫調節等作用[20]。甘草次酸為五環三萜類化合物，具有抗炎、抗免疫等作用[21]。科羅索酸為五環三萜類化合物，具有抗腫瘤、降血糖、抗炎、抗氧化等作用[22]。山楂酸為五環三萜化合物，具有抗腫瘤、降糖、抗菌、抗炎、神經保護等作用[23]。路路通酸具有抗炎鎮痛等作用[24]。鞣花酸為多酚二內酯化合物，具有抗氧化功能、抗癌、抗突變性能等作用[25]。通過分析可知，排名靠前的關鍵化合物多數為黃酮類化合物和五環三萜類化合物，具有抗炎，抗病毒的作用，可能對于COVID-19具有一定的防治作用。通過對藥材-化合物-靶點網絡和COVID-19靶點與二十五味肺病丸共同靶點的蛋白互作分析可知初步篩選出可能潛在的關鍵靶點PTGS2、ESR1、AKT1、EGFR等，二十五味肺病丸可能作用于以上關鍵靶點并通過靶點蛋白之間的相互作用對COVID-19起到一定的防治作用，此外通過通路富集分析，得出與肺相關的疾病通路、炎癥、免疫相關通路，二十五味肺病丸可能作用于以上通路，對COVID-19起到一定的防治作用，但具體情況還有待進一步研究。

自疫情爆發以來，中醫藥成為治療COVID-19的重要力量，與此同時尋找其他的治療方式也極為重要，本研究以藏藥二十五味肺病丸為研究基礎，探討二十五味肺病丸防治COVID-19的可行性和機制探討，發揮藏醫藥在防治COVID-19過程中起到的相應作用，藏醫藥同樣是祖國醫學寶庫中的瑰寶，在我國醫藥學中是僅次于中醫藥的一門民族醫藥，另外本研究有利于促進探尋通過藏醫藥防治COVID-19的方法，為早日戰勝疫情提供相應的幫助。