鴨凝血因子Ⅷ的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

劉 英，唐小涓，劉靜靜，張?chǎng)╄囥畹慢垼?*

（1. 西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶402460；2. 西南大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院免疫學(xué)研究中心，重慶402460）

鴨疫里默氏菌（Riemerellaanatipestifer）是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的疫病之一，極易感染2~3周齡雛鴨[1-3]。鴨感染鴨疫里默氏菌后以嚴(yán)重肝損傷為主要特征，表現(xiàn)為典型的纖維素性肝包炎、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管通透性增加。內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的重要組成部分，在調(diào)節(jié)血流、血小板激活、白細(xì)胞黏附等過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是多種滲出性炎癥發(fā)生過程中的促進(jìn)因素，因此分離得到鴨肝竇內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)研究R.anatipestifer 致病機(jī)制有重大意義。Ⅷ因子常用來鑒定肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。但是，目前Ⅷ因子相關(guān)試劑和試劑盒主要集中在人或小鼠上，市面上缺乏鴨Ⅷ因子的相關(guān)試劑。因此，本研究擬制備鴨凝血因子Ⅷ多克隆抗體，為后續(xù)鴨肝竇內(nèi)皮細(xì)胞鑒定提供試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

6~8周齡試驗(yàn)小鼠購自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 試劑

HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 購自Sigma 公司；DNA Ligation Kit、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鴨Ⅷ因子克隆與分析

根據(jù)NCBI 鴨Ⅷ因子序列（GenBank 登錄號(hào)XM_027465529.1）設(shè)計(jì)6 對(duì)引物，分段擴(kuò)增Ⅷ-1、Ⅷ-2、Ⅷ-3、Ⅷ-4、Ⅷ-5和Ⅷ-6，并設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，見表1。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。

雛鴨放血處死后，采集肝臟，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min，（94 ℃ 30 s，52~55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min）×35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

將回收的目的片段與T-載體連接，轉(zhuǎn)化至E. coliDH5α，涂布LB 平板（Amp+），挑取單菌落，搖菌后提取質(zhì)粒，鑒定正確后送武漢金開瑞生物工程有限公司測(cè)序，并利用生物學(xué)軟件進(jìn)行分析。……