奶牛乳腺源大腸桿菌NJ17 crp基因缺失株的構建及其生物被膜形成能力分析

王 冉，呂俊凡，吳自豪，陳 偉

（塔里木大學動物科學學院，新疆阿拉爾843300）

腸道致病性大腸桿菌是引起奶牛乳腺炎的重要致病菌，不同地區大腸桿菌分離情況存在地區差異[1-3]。大腸桿菌內毒素（lipopolysaccharide，LPS）具有熱穩定性，其在原料乳中的殘留可對動物性食品安全造成潛在風險，限制中國奶業的健康發展[4]。目前，大腸桿菌所引起的動物和人腸道腹瀉的致病機制已經較為清晰，但作為奶牛乳腺致病菌的感染機制尚不清楚。

Crp（cAMP receptor protein）是 cAMP 的受體蛋白，由基因crp編碼。cAMP作為細菌中普遍存在的第一信使，可以調控毒力基因表達，調控細菌胞外多糖合成，從而影響細菌生物被膜形成[5]。Crp 與cAMP 結合后形成cAMPCrp 復合體，可促進TCA 循環，調控代謝途徑的多個基因[6]。因此，Crp蛋白在病原菌致病性、毒力因子產生等方面發揮重要作用。

本研究組于2017 年從患牛乳樣中分離獲得1 株大腸桿菌，命名為NJ17，是一種腸致病型大腸桿菌（EPEC）。為探究crp基因對奶牛乳腺源大腸桿菌NJ17 生物被膜形成能力的影響，本研究采用λ-Red同源重組技術，構建crp基因缺失株，并對其生長速率和生物被膜形成能力進行分析，為后續進一步研究crp基因功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

奶牛乳腺源大腸桿菌NJ17（EPEC）由乳腺炎患牛體內分離獲得。大腸桿菌DH5α 購自大連寶生物工程有限公司。pKD3（氯霉素抗性）、pKD46（卡那霉素抗性）由上海獸醫研究所饋贈。

1.2 培養基及培養條件

LB培養基用于細菌的常規培養，SOC培養基用于電轉化后的菌株復蘇。λ-Red 重組酶誘導表達，需添加10 mmol/L阿拉伯糖。……